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一.应用GC-rich载体提高CHO细胞表达抗CD20抗体的能力构建合适的高表达载体是提高CHO等哺乳动物细胞表达外源重组蛋白能力的有效手段。目前工业生产上使用最多的高表达载体主要有两类：一类以二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase, DHFR)为筛选因子；另一类则以谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase, GS)为筛选因子。这两类载体都是基于基因共扩增的原理达到增加目的基因拷贝数进而提高表达量的目的,但是这两类载体都存在筛选过程冗长,同时筛选压力移除后表达不稳定的问题。因此开发新型的高表达载体依然是我们所面临的任务。大量文献已经报道Sp家族蛋白和Kruppel家族蛋白是真核细胞中两类十分重要的转录因子,它们被证实通过与GC box相结合调节目的基因的表达水平。基于上述事实,本实验通过在普通载体的表达框附近添加富含GC的片段构建了GC-rich载体,并用该载体分别携带抗CD20抗体的轻链基因和重链基因,共转染进CHO细胞中,经G418筛选两周,随机克隆,并且与GC-rich(-)对照载体进行同步比较,结果显示使用GC-rich载体挑取的克隆阳性率为47%(45/96),而使用对照载体筛选到阳性克隆率仅为6%(6/96)；ELISA同步检测,OD450最大值分别为0.62和0.37。继续将所挑取的高表达细胞克隆(CHO-2F2-K2)放大培养,表达3天,可获得抗体表达量为33mg/L,比本实验室原先的抗体表达水平提高10倍以上。由此,我们初步得到以下结论：GC-rich片段不仅增加了筛选克隆的阳性率,并且确实一定程度上提高CHO细胞表达抗CD20抗体的能力。二.CHO细胞悬浮培养抗体表达过程中,活细胞的密度是影响表达量的重要因素之一。为了进一步提高抗CD20抗体的表达水平,同时考虑到动物血清存在成分不明确(可能携带有牛病毒或未知毒素等不稳定因子)以及价格昂贵等不利因素,我们采取逐步降低血清浓度的方式驯化细胞克隆株CHO-2F2-K2,驯化两个月后,细胞株完全适应无血清培养基EX-CELL302,最大活细胞密度可达1.6×106cells/ml,抗体表达量达到96mg/L。进而采用批次补料的策略培养表达,最大活细胞密度增至5.3×106cells/ml,抗体表达量也相应增加到154mg/L,相比于未补料的摇瓶培养分别提高了230%和60%。为了与工业化生产接轨,我们又在5L搅拌式生物反应器中做了批次补料发酵的初步实验,结果最大活细胞密度和抗体表达量分别达到了6.4×106cells/ml和200mg/L。综上所述,我们驯化了细胞克隆CHO-2F2-K2,从而提高了蛋白表达过程中的活细胞密度,并且在生物反应器中通过批次补料的方式表达抗CD20抗体,初步实现了100-200mg/L的表达水平,为接下来的工艺优化奠定了基础。三.抗CD20抗体定点偶联小分子药物的研究抗体偶联药物,简称ADCs,是一类将抗癌制剂偶联于抗体的生物药物。与传统的抗肿瘤药物相比,ADCs具有靶向性更强,毒副作用更小的优点,目前已在临床显示出极大的应用价值,并且有望成为未来人类对抗癌症的强力武器。但是传统的以赖氨酸的侧链胺基或链间二硫键还原巯基结合药物的偶联方式会导致产物的不均一,而且可能破坏抗体固有的结构降低其亲和性。本实验参考Jagath R Junutula等人的设计思路在抗CD20抗体2F2上突变产生四个可用于偶联的半胱氨酸残基,突变抗体HLM经GC-rich-CHO系统表达。初步检测亲和性后,将HLM与vcMMAE偶联,HPLC分析产物纯度,紫外可见分光光度仪检测偶联比,进一步流式细胞仪检测偶联物的亲和性以及细胞活性。结果表明：HLM-vcMMAE不仅保持了原抗体2F2的亲和力,并且直接杀伤细胞的能力比原抗体提高很多。