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布氏菌病（Brucellosis，布病）是一类由布氏菌引起的常见人畜共患传染病。据世界卫生组织调查，全球已有170多个国家和地区有布病发生和流行。由于长期使用抗生素治疗布病会造成细菌耐药，所以接种疫苗是预防布病最实际、最有效的措施。当前我国预防布病使用的牛种弱毒株104M菌株是国内现有唯一人用布氏疫苗，接种方式为皮上划痕。但皮上划痕接种有诸多弊端，包括难以确定有效接种量、接种复杂、皮肤遗留疤痕、皮肤疼痛以及伴有其他异常反应等。因此改善疫苗的接种方法对于有效预防布病十分必要。粘膜是机体抵抗外来感染的主要屏障，经滴鼻免疫后可以在系统和粘膜内产生针对抗原的特异性免疫反应。滴鼻疫苗具有安全性好，接种简便等优点，且诱发的系统免疫有较好的交叉免疫保护效果。因此，本研究用滴鼻免疫的方式代替传统落后的皮上划痕接种方式，分别以小鼠和豚鼠为动物模型，通过体液免疫、粘膜免疫、细胞免疫应答以及主、被动免疫保护力试验结果全面评价疫苗的免疫原性和保护力。冻干保护剂直接与疫苗冻干后的活菌率和稳定性相关联，故本文也对布氏疫苗的制备进行了研究，主要讨论冻干保护剂中明胶浓度对布氏菌活疫苗活菌率的影响，为布氏疫苗保护剂中最佳明胶浓度的确定提供理论依据。 本研究主要内容包括：⑴将布氏杆菌104M株菌种接种到代肝琼脂培养基，转种，扩大培养，用含明胶浓度分别为0％、0.25%、0.5%、1%的4种保护剂收获。经浓度测定，调配浓度，冷冻干燥，封口等步骤，制备1000亿/mL和5亿/mL两种浓度的布氏菌活疫苗，测定冻干后布氏疫苗的活菌数。4 oC保存样品冻干封口后2天、2周、1个月、3个月测定活菌数。37 oC保存样品冻干封口后2周、1个月测定活菌数。结果表明，冻干保护剂中明胶的浓度愈高，布氏疫苗的活菌率愈低，且稳定性越差。⑵以小鼠为动物模型，滴鼻免疫布氏菌活疫苗，观察其免疫应答效果。免疫4周后，对小鼠进行摘眼球采血及制备血清，制备脾淋巴细胞以及肺鼻灌洗液。间接ELISA法检测血清中Br-PPD蛋白特异性IgG抗体水平，肺鼻灌洗液中Br-PPD蛋白特异性IgG、IgA抗体水平及体外再刺激后小鼠脾细胞分泌IFN-γ、IL-4水平；ELISPOT法检测分泌IFN-γ、IL-4的脾脏细胞数目；流式细胞术对T细胞内IFN-γ、IL-4细胞因子染色检测。结果显示，免疫组小鼠血清中IgG抗体水平，肺鼻灌洗液中IgG、IgA抗体水平均明显高于对照组；分泌IFN-γ的脾脏淋巴细胞数，体外再刺激后小鼠脾细胞分泌IFN-γ的水平及脾淋巴细胞中CD4+IFN-γ+细胞比例均明显高于阴性对照组。结果表明，在小鼠模型中，滴鼻免疫途径可行，免疫后诱导小鼠产生较高的体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫应答。⑶以豚鼠为动物模型，滴鼻免疫布氏菌活疫苗，观察其免疫应答效果。免疫4周后，对豚鼠进行心脏采血及制备血清（保存部分血清用于血清被动保护力试验），制备肺泡灌洗液以及鼻腔灌洗液。间接ELISA法检测豚鼠血清中Br-PPD蛋白特异性IgG抗体水平，肺鼻灌洗液中Br-PPD蛋白特异性IgG、IgA抗体水平。采血3天后，皮内注射PPD变态反应原，注射24 h后观察注射部位出现红肿反应，并测量平均硬结反应直径，以纵、横直径相加平均数不小于5 mm作为阳性标准，计算阳性反应率。结果显示，免疫组豚鼠血清IgG抗体水平，肺鼻灌洗液中IgG、IgA抗体水平均明显高于对照组；免疫组动物对PPD抗原24 h后的DTH阳转率均为100%。结果表明在豚鼠模型中，滴鼻免疫途径可行，免疫后诱导豚鼠产生较高的体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫应答。⑷以小鼠为动物模型，滴鼻免疫布氏菌活疫苗，免疫4周后，对小鼠以滴鼻和皮下两种途径攻击羊种布氏菌M5弱毒株；滴鼻攻击羊种布氏菌XJ91-60强毒株、国际标准菌株(羊种55210株、猪种55213株、犬种55226株)、国内强毒布氏菌株（猪种8506株、犬种D042株）。攻击4周后，无菌条件下解剖小鼠，取其脾脏，放入研磨器中研磨，接种含1：10万硫堇染料的TSA平皿培养基中培养，以脾脏菌荷量为保护力评价指标。结果显示，免疫组小鼠脾脏没有分离到感染菌，阴性组分离出大量的布氏菌。试验表明滴鼻免疫途径可行，使得小鼠获得很好的免疫保护力。⑸以豚鼠为动物模型，滴鼻免疫布氏菌活疫苗，免疫4周后，对豚鼠以滴鼻和皮下两种途径攻击羊种布氏菌M5弱毒株，剂量为5×108CFU/只。攻击3周后，无菌条件下解剖豚鼠，取其脾脏，放入研磨器中研磨，接种含1：10万硫堇染料的TSA平皿培养基中培养，以脾脏菌荷量为保护力评价指标。结果显示，免疫组豚鼠脾脏荷菌量与阴性组相比差异有统计学意义。试验表明滴鼻免疫途径可行，使得豚鼠获得很好的免疫保护力。⑹以小鼠为模型，进行豚鼠血清被动保护力试验。将原倍豚鼠血清、10倍稀释豚鼠血清、100倍稀释豚鼠血清对小鼠进行腹腔注射，用羊布氏菌M5弱毒株对所有小鼠进行后肢皮下攻击，剂量为1×108CFU/只。攻击4周后，无菌条件下解剖小鼠，取其脾脏，放入研磨器中研磨，接种TSA平皿培养基中培养，以脾脏菌荷量为保护力评价指标。结果显示，原倍豚鼠血清、10倍稀释豚鼠血清注射组小鼠脾脏荷菌量与阴性组相比差异有统计学意义。表明经滴鼻免疫的豚鼠血清对小鼠羊布氏菌M5菌攻击有较好的被动保护效果，同时也说明布氏疫苗滴鼻免疫产生的抗体具有较好的免疫保护作用。