一、背景与目的毛茛科植物乌头和附子具有祛风除湿,温经止痛等功效,是中医临床上治疗风湿性关节炎等风湿痹症和心血管疾病的常用中药,具有局麻、镇痛、镇静、强心、抗炎、抗肿瘤等药理作用。但是由于乌头和附子的治疗窗窄,毒性大,导致了其在临床使用上中毒事件的频频发生。尽管经过炮制,乌头和附子的毒性已降低,但其应用仍受到了极大的限制。二萜类生物碱是乌头和附子的主要活性成分,约占总重的7-10%,同时也是毒性成分。它的毒性基团主要为C8的乙酰基,C13的羟基,C14的苯甲酰基和结构上的甲氧基等。二萜类生物碱,尤其是双酯型生物碱,具有很强的毒性,其主要毒性反应表现为心脏毒性和神经毒性。二萜类生物碱包括双酯型生物碱,单酯型生物碱和醇胺型生物碱。双酯型生物碱,包括乌头碱(AC),中乌头碱(MA)和次乌头碱(HA),是未加工的生乌头和生附子的主要活性和毒性成分。乌头和附子在临床上使用时需经过长时间的煎煮,使毒性强的双酯型生物碱大部分水解为毒性较弱的单酯型生物碱和醇胺型生物碱。所以单酯型生物碱和醇胺型生物碱是乌头和附子水煎液的主要活性成分。单酯型乌头生物碱包括苯甲酰乌头原碱(BAC),苯甲酰中乌头原碱(BMA)和苯甲酰次乌头原碱(BHA)；醇胺型乌头生物碱包括乌头原碱(Aconine),中乌头原碱(Mesaconine)和次乌头原碱(Hypaconine)。虽然单酯型和醇胺型生物碱毒性小于双酯型生物碱,但临床使用不当,过多摄入单酯型和醇胺型生物碱仍然会发生中毒反应。药物代谢酶如CYP450, UGT和SULT酶等,和外排转运蛋白如P-gp, BCRP和MRP2等,是机体抵御外源性物质,特别是有毒物质的重要防线。药物经吸收入血后,大多数在药物代谢酶的作用下发生一相或二相代谢使药物极性增大,降低药物的毒性和活性,便于快速排出体外。外排转运蛋白能将经胃肠道吸收的药物外排至肠腔,阻止其吸收入血,降低药物生物利用度,同时也能阻止有毒物质入血,对机体起保护作用。本课题组的前期研究发现二萜类生物碱主要受CYP450酶的介导发生Ⅰ相反应,并没有发现经UGT和SULT酶介导的Ⅱ相代谢反应。本实验室已对毒性较强的双酯型乌头生物碱进行了代谢机理研究,发现在人肝微粒体的作用下,乌头碱主要在CYP3A4和CYP3A5的介导下生物转化为毒性较小的代谢物,CYP2C8,2C9和2D6起次要作用,代谢途径包括脱甲基,脱氢,脱乙基和羟基化。而中乌头碱的代谢除了受到CYP3A4和CYP3A5的介导外,同样也受到CYP2C8,2C9和2D6的影响,代谢途径为脱甲基,脱氢,脱甲基-脱氢和羟基化。参与次乌头碱代谢的主要酶亚型为CYP3A4和CYP3A5,其次为CYP2C8,2C9,2D6和2E1,代谢途径包括脱甲基,脱甲基-脱氢,脱双甲基和羟基化。乌头和附子在临床上使用时需经过长时间的煎煮,其主要活性成分为毒性较弱的单酯型生物碱和醇胺型生物碱,而不是毒性较强的双酯型生物碱。目前,单酯型生物碱和醇胺型生物碱的代谢途径和参与代谢的主要酶亚型尚未研究清楚。本实验室采用Caco-2细胞模型和MDR1-MDCKII细胞模型证明了双酯型乌头生物碱(AC, MA, HA)的吸收转运受到外排转运蛋白P-gp的介导,同时也可能受到BCRP和MRP2的影响；单酯型乌头生物碱可能受到MRP2的介导；原碱型乌头生物碱的吸收转运则完全不受外排转运蛋白的影响。然而,Caco-2细胞模型虽然是研究小肠表皮细胞药物转运和代谢的较理想的体外模型,但其存在一定的缺陷,如培养周期过长、缺少黏液层、紧密连接过紧以及表达转运载体与酶的数量和种类同人体小肠的差异等,提示Caco-2细胞并非模拟人体小肠上皮细胞的理想模型。且Caco-2细胞模型同时表达多种外排转运蛋白,如P-gp,BCRP和MRP2等,它们的底物均较广泛,在对药物的外排作用中容易相互干扰。而过表达单一外排转运蛋白的MDCKⅡ细胞模型则可以排除其他外排转运蛋白的干扰。如MDR1-MDCKⅡ细胞模型高表达P-gp,能专一地评价P-gp在药物外排中的作用,所以常用于检测P-gp底物和抑制剂的活性。目前,本实验室已在过表达P-gp的MDR1-MDCKⅡ细胞上,证明P-gp介导双酯型乌头生物碱的吸收转运,对单酯型和醇胺型乌头生物碱却无介导作用。而外排转运蛋白BCRP和MRP2在Caco-2细胞上证明可能参与了乌头生物碱的吸收转运,其外排机制尚需深入阐明。所以有必要采用过表达BCRP的BCRP-MDCKⅡ,过表达MRP2-MDCKⅡ细胞模型进一步研究BCRP和MRP2对二萜类乌头生物碱的介导作用。基于以上研究现状,本课题的研究目的是基于药物代谢酶CYP450研究乌头和附子水煎液的主要活性成分(单酯型和醇胺型乌头生物碱)的代谢特征；采用过表达外排转运蛋白BCRP和MRP2的MDCKⅡ细胞模型研究二萜类生物碱(双酯型,单酯型和醇胺型生物碱)的吸收特征。阐明乌头生物碱的吸收和代谢机理,从而科学地认知乌头生物碱的毒性,为乌头和附子的毒性和临床应用提供理论依据。二、实验方法1.CYP450酶的代谢研究采用经典的Ⅰ相反应体系,使用人肝微粒体,化学抑制剂,单克隆抗体和人源化重组CYP酶,运用液质联用(UPLC-MS/MS)分析方法研究参与单酯型和醇胺型生物碱的代谢途径；运用高分辨质谱(HRMS)分析方法鉴定在人肝微粒体的作用下单酯型和醇胺型生物碱的代谢产物。2. BCRP, MRP2外排转运蛋白的吸收转运研究采用MDCKⅡ, BCRP-MDCKⅡ和MRP2-MDCKⅡ细胞模型,联合使用外排转运蛋白抑制剂,运用高效液相质谱联用技术进行分析,研究外排转运蛋白BCRP和MRP2对乌头生物碱(双酯型,单酯型和醇胺型生物碱)吸收转运的介导作用。三、实验结果1.单酯型乌头生物碱体外CYP酶作用下的代谢机理研究苯甲酰乌头原碱BAC在人肝微粒体的介导下至少生成7个Ⅰ相代谢产物(M1-M7)(图3-5)。这主要的代谢途径包括脱氢,去甲基,脱氢去甲基,脱乙基,脱乙基脱氢。我们选用了一系列CYP酶亚型的特异性化学抑制剂去确认参与BAC代谢的CYP酶亚型,结果见图3-9。由结果推断BAC的代谢主要是受到CYP3A的介导,CYP2C9和CYP1A2也有一定的作用,其他代谢酶如CYP2C8,2C19,2D6,2E1几乎不参与BAC的代谢。由于化学抑制剂的抑制效果并不能达到100%,且化学抑制剂的专属性并不好,在高浓度的时候会抑制其他的CYP酶亚型。所以我们采用了专属性更好的单克隆抗体验证参与BAC代谢的酶亚型。结果表明只有anti-CYP3A4/5的单克隆抗体对BAC的代谢有显著的抑制效果,其他酶亚型的抗体几乎不起作用,结果见图3-10。此外,一系列的人源化重组CYP酶被用来进一步验证参与BAC的CYP酶亚型。结果见图3-12,在BAC的代谢中,CYP3A4发挥着最重要的作用；其次为CYP3A5。CYP2D6也能介导代谢产物M5的生成,CYP1A2,2C8,2C9,2C19和2E1的作用很小。苯甲酰中乌头原碱BMA在人的肝微粒体的作用下至少生成8个代谢产物(M1-M8)(图4-5)。这主要的代谢途径包括脱氢,去甲基,脱氢去甲基,羟基化。我们选用了一系列CYP酶亚型的化学抑制剂去确认参与BMA代谢的CYP酶亚型,结果见图4-9。由结果推断BMA的代谢主要是受至CYP3A的介导,其次为CYP2C9。 CYP2C8,2C19对部分代谢产物如M1, M2, M3, M4, M7和M8,也有一定的作用,其他代谢酶如CYP1A2,2D6,2E1几乎不参与BMA的代谢。我们采用了专属性更好的单克隆抗体进一步验证参与BMA代谢的酶亚型。结果表明只有anti-CYP3A4/5的单克隆抗体显著抑制BMA的代谢,其他酶亚型的抗体不起作用,结果见图4-10。此外,一系列的人源化重组CYP酶被用来进一步验证参与BMA的CYP酶亚型。结果见图4-12,在BMA的代谢中,CYP3A4发挥着最重要的作用；其次为CYP3A5。CYP1A2,2C8,2C19,2D6,2E1对代谢产物M5,脱甲基苯甲酰中乌头原碱的生成也有一定的作用。而CYP2C9则对BMA的代谢不起作用。苯甲酰次乌头原碱BHA在人肝微粒体参与下至少生成9个代谢产物(M1-M9)(图5-4)。这主要的代谢途径包括脱氢,去甲基,脱氢去甲基,羟基化。我们选用了一系列CYP酶亚型的化学抑制剂去确认参与BHA代谢的CYP酶亚型,结果见图5-9。由结果推断BHA的代谢主要是受至CYP3A的介导,其次为CYP2C9。CYP2C8,2C19对部分代谢产物如M3,M4,M7和M8,也有一定的作用,其他代谢酶如CYP1A2,2D6,2E1几乎不参与BHA的代谢。采用单克隆抗体实验进一步验证参与BHA代谢的CYP酶亚型。结果表明只有anti-CYP3A4/5的单克隆抗体对BHA的9个Ⅰ相代谢产物的生成有显著地抑制作用,其他酶亚型的抗体对BHA的代谢几乎没影响,结果见图5-10。此外,一系列的人源化重组CYP酶被用来进一步验证参与BHA的CYP酶亚型。结果见图5-12,在BHA的代谢中,CYP3A4发挥着至关重要的作用,其次为CYP3A5。而CYP1A2,2C8,2C9,2C19,2D6和2E1几乎不参与BHA的代谢。2.醇胺型乌头生物碱体外CYP酶的代谢研究醇胺型乌头生物碱,包括乌头原碱(Aconine),中乌头原碱(Mesaconine)和次乌头原碱(Hypaconine),几乎不被人肝微粒体中的CYP酶代谢。经过低分辨质谱的鉴定,在肝微粒体的作用下Aconine能产生一个脱氢代谢产物,Mesaconine能被代谢生成脱甲基代谢产物,Hypaconine则能生物转化为脱甲基-脱氢-次乌头原碱。醇胺型乌头生物碱的代谢率均极低,除了发现少量水解产物外,大部分以原型形式存在。3.双酯型,单酯型和醇胺型乌头生物碱被BCRP和MRP2外排转运蛋白处置的机制我们首次利用MDCKⅡ, BCRP-MDCKⅡ和MRP2-MDCKⅡ细胞研究了双酯型乌头生物碱(AC, MA, HA),单酯型乌头生物碱(BAC, BMA, BHA),醇胺型乌头生物碱(Aconine, Mesaconine, Hypaconine)的吸收转运情况。在BCRP-MDCKⅡ细胞,AC, MA和HA从B到A方向的转运比其从A到B方向的转运要快得多(P<0.05,图7-5)。它们在BCRP-MDCKⅡ细胞的外排转运率Er值分别是31.99±1.66,9.74±2.61,6.07±0.39,显著性高于它们在MDCKⅡ细胞中的值(1.62±0.13,0.88±0.23,0.80±0.16)。从A到B方向转运或从B到A方向转运,AC, MA和HA在BCRP-MDCKⅡ细胞的含量都显著的小于它们在MDCKⅡ细胞的含量(P<0.05,图7-6)。综合BAC, BMA, BHA, Aconine, Mesaconine和Hypaconine在MDCKⅡ和BCRP-MDCKⅡ细胞的Er值和细胞内药物含量(表7-1,图7-6),结果表明BCRP并不参与单酯型和醇胺型乌头生物碱的吸收转运。在MRP2-MDCKⅡ细胞,AC, MA, HA, BAC, BMA和BHA从B到A方向的转运比其从A到B方向的转运快,AC, MA, HA, BAC, BMA和BHA在MRP2-MDCKⅡ的外排转运率Er值显著地(P<0.05)大于它们在MDCKⅡ细胞中的值,分别是(6.38±0.27)比(1.62±0.27),(5.90±0.46)比(1.89±0.22),(2.18±0.22)比(0.92±0.09),(1.59±0.25)比(1.08±0.07),(1.67±0.21)比(1.23±0.03),(1.89±0.18)比(1.23±0.07)。在MRP2的抑制剂LTC4作用下,AC, MA, HA, BAC, BMA和BHA的外排转运率显著地减少,而细胞内的含量均显著地增多(P<0.05,表7-2,图7-8),这表明MRP2参与了AC, MA, HA, BAC, BMA和BHA在细胞中的转运。综合Aconine, Mesaconine和Hypaconine在MDCKⅡ和MRP2-MDCKⅡ细胞的Er值,细胞内药物含量,以及抑制剂实验结果(表7-2,表7-3,图7-8,图7-9),研究表明外排转运蛋白MRP2不参与这醇胺型乌头生物碱的吸收转运。综合以上实验,我们得知BCRP参与了AC, MA和HA在细胞的吸收转运。MRP2参与了AC, MA, HA, BAC, BMA和BHA在细胞中的转运。而BCRP和MRP2均不参与Aconine, Mesaconine和Hypaconine的转运。外排转运蛋白对二萜类乌头生物碱在细胞的吸收转运的影响：AC, MA, HA> BAC, BMA, BHA>Aconine, Mesaconine, Hypaconine。三、结论1.单酯型乌头生物碱(BAC, BMA, BHA)在CYP450酶的作用下,分别产生了7,8,9个代谢产物,代谢途径主要为脱甲基,脱氢,脱甲基-脱氢,脱乙基,羟基化。乌头生物碱的毒性归因于C8位的乙酰基,C14位的苯甲酰基,C1,6,16,18位的甲氧基,在代谢过程中乌头生物碱脱掉这些基团可降低其毒性。从结构推断,BAC, BMA和BHA的脱甲基,脱甲基-脱氢和脱乙基代谢产物的毒性比原型小,对机体有保护作用。2.醇胺型乌头生物碱(Aconine, Mesaconine, Hypaconine)在人肝微粒体的作用下几乎不被代谢。综合本实验室前期研究和本课题的实验,我们得知CYP450酶对乌头生物碱的代谢影响：双酯型生物碱>单酯型生物碱>醇胺型生物碱。3. BCRP和MRP2对乌头生物碱(AC, MA, HA, BAC, BMA, BHA, Aconine, Mesaconine, Hypaconine)转运的介导作用：双酯型生物碱>单酯型生物碱>醇胺型生物碱。毒性越大,受到外排的影响越大。因此,CYP450酶和BCRP, MRP2外排转运蛋白共同调控乌头生物碱体内过程,限制其吸收进入血液循环,防止发生中毒反应,对机体在一定程度上具有保护作用。