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RNA沉默(RNA silencing)是植物抵抗病毒侵染的有效途径,它通过降解病毒基因组起到抑制病毒复制和侵染的作用。然而,几乎所有植物病毒均能编码RNA沉默抑制子(viral suppressors of RNA silencing, VSR)来抵抗寄主的这种防御反应,达到顺利侵染、复制并系统扩散的目的。不同病毒来源的VSR抑制RNA沉默的机制不同,如番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus, TBSV)编码的p19,可与siRNA结合,阻止siRNA进入沉默诱导复合体(RNA-induced silencing complex, RISC);芜菁黄花叶病毒(Turnip yellow mosaic virus, TYMV)编码的p69可结合RNA沉默过程中的dsRNA,抑制RNA沉默的发生；黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)编码的2b与AGO (Argonaute)相互作用,抑制植物RNA沉默。VSR在植物体内的表达,有时也会对植物内源siRNA和miRNA途径、以及mRNA表达谱造成影响,导致植株生长、发育异常；但有些VSR并不造成这些影响。本文针对马铃薯X病毒(Potato virus X, PVX)编码的沉默抑制子p25和水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)编码的沉默抑制子p3开展深入研究,揭示了植物体通过抑制p25功能抗PVX侵染的一条新途径；明确了RSV p3蛋白通过诱导水稻体内抗性相关基因表达起到提高水稻对病原物抗性的作用。p25是PVX编码的一个多功能蛋白,同时具有运动功能和沉默抑制子功能。作为运动蛋白,p25与其它两个TGB蛋白—-TGBp2和TGBp3协助PVX进行细胞间运动和系统运动；作为病毒RNA沉默抑制子,p25通过与RNA沉默机制核心蛋白AGO互作,阻止其形成RNA诱导沉默复合体结合(RISC),从而抑制RNA沉默机制。我们通过酵母双杂交(Yeast two hybride, Y2H)系统从本氏烟(Nicotiana benthamiana)cDNA文库中筛选分离到一个与p25互作的丝氨酸类蛋白酶抑制剂(Proteinase inhibitor, PI)蛋白,命名为NbPI。利用双分子荧光互补(Biomolecular fluorescence complementary, BiFC)技术在体内验证了两者的互作。研究发现,通过VIGS系统沉默NbPI,会导致PVX症状加强,病毒RNAs积累量增多；相反,植株过表达NbPI则表现出对PVX侵染的抗性,表现在症状显著减轻,病毒RNAs积累量显著下降。进一步研究发现,NbPI的瞬时表达会轻微抑制p25的沉默抑制子功能,但显著抑制其运动功能。研究还发现,PVX侵染会导致本氏烟体内NbPI基因表达下调。基于此,我们认为NbPI通过抑制p25的功能参与了寄主抵抗PVX侵染过程,而PVX则可能通过抑制NbPI表达来对抗这条抗性途径。RSV是纤细病毒属病毒,其基因组包括四条单链RNA,除RNA1反义编码RNA依赖RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase, RdRp)外,其它三条链都以双义编码策略表达,分别含有两个不重叠的开放阅读框(open reading frame, ORF),中间为非编码间隔区(intergenic regions, IRs)。RNA3编码的p3蛋白是RNA沉默抑制子。研究发现,p3在水稻体内的表达对水稻正常发育没有造成显著影响。对转基因水稻接种RSV发现,在RSV侵染早期,水稻对RSV敏感性增强,表现在症状加重,病毒积累量增多；而在侵染后期,转p3基因水稻症状变得比对照轻,而病毒积累量却没有明显变化。芯片检测发现,转p3基因水稻植株中内源microRNA表达和mRNA表达谱均受到一定影响；进一步分析发现一些病程相关蛋白(PR)蛋白与NBS-LRR-like基因表达上调。抗病分析实验结果显示,转p3水稻对水稻白叶枯病(bacterial blight, Xanthomonas oryzae)与稻瘟病(rice blast disease, Magnaporthe oryzae)的抗性增强。结果说明,p3基因通过诱导抗性相关基因的表达提高了水稻对病原物的抗性。我们也检测了转p3基因水稻植株中水杨酸(salicylic acid, SA)和茉莉酸(jasmonic acid, JA)途径中一些重要基因的表达,发现这些基因在转p3基因水稻中的表达没有发生显著差异。因此,我们推测转p3基因水稻对白叶枯病和稻瘟病的抗性可能不依赖于SA和JA途径。在转p3基因本氏烟上,我们接种RSV后发现病毒症状较轻,且病毒的发病率和积累量显著降低。下一步我们将利用转基因水稻和本氏烟开展p3诱导寄主防卫反应的机制研究。RSV由四条RNA链组成,RNAs2-4是以双义编码策略,两阅读框由中间非编码间隔(intergenic regions, IRs)分开,IRs被认为具有转录终止的功能。本文中,以感染RSV的水稻(Oryza sativa)、本氏烟(Nicotiana benthamiana)和昆虫介体灰飞虱(LaodelpHax striatellus)为材料,分析三者RSV RNA1-4转录物的3’-UTRs(3’-untraslated regions)序列,明确转录物在IRs区域的终止位点。结果表明,RNA2的p2、pc2转录序列和RNA4的p4、 pc4转录序列是在高度保守回文序列AUCCGGAU终止。AUCCGGAU位于二级发夹结构区域,且AUCCGGAU序列在三个不同寄主分离到的RSV基因组RNA2、RNA4IR和其它纤细病毒属RNAs组中高度保守。另外,实验结果显示,在三个不同寄主中RSV p3的转录终止位点是同一位置,而pc3在不同寄主中的转录终止位点却不同。RNA1pcl的转录终止是在RNA1的3’末端,表明pcl转录本的合成与复制过程同时完成。此研究结果首次确定了植物反义RNA病毒的转录终止位点,为了解RSV和其它植物反义病毒的转录方式提供依据。