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目的：乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，乳腺癌细胞的侵袭转移是危及乳腺癌患者生命的重要因素。上皮间质转化（EMT）使乳腺癌细胞失去上皮标志，获得间质表型，表现出极强的侵袭、迁移能力，导致肿瘤转移，并且促使转移肿瘤细胞干细胞化，产生对化疗药物的抵抗。E-钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）分别表达于上皮细胞、间质细胞，是发生EMT的标志。研究表明，OCT4是诱导干细胞的一个关键转录因子，与维持肿瘤干细胞的自我更新能力和分化潜能性有关，参与了许多类型肿瘤细胞增殖和凋亡的调控。然而，关于OCT4对肿瘤侵袭转移的影响还研究甚少。本实验主要研究EMT相关因子E-cadherin和vimentin以及干细胞因子OCT4在乳腺癌中的表达，以此来探讨EMT与乳腺癌干细胞之间的相关性，并进一步通过RNA干扰技术下调乳腺癌细胞中OCT4的表达，并研究OCT4表达降低对乳腺癌细胞侵袭、转移、增殖和凋亡的影响。方法：1利用实时荧光定量PCR方法检测肿瘤干细胞标记物OCT4、EMT相关因子E-cadherin和vimentin mRNA在浸润性乳腺癌组织和癌旁组织中的表达水平；2利用免疫组织化学方法检测OCT4以及E-cadherin和vimentin在浸润性乳腺癌组织中蛋白水平的表达，并分析其表达与临床病理特征及预后的关系；3用三质粒系统包装293T细胞，产生慢病毒，感染乳腺癌细胞MDA-MB-231，同时用control-shRNA-pLKO.3做阴性对照，感染72h后收集细胞检测；4利用荧光显微镜和流式细胞术检测control-shRNA-pLKO.3和OCT4-shRNA-pLKO.3在MDA-MB-231细胞中的感染效率；5利用实时荧光定量PCR和Western blot法鉴定病毒感染MDA-MB-231细胞后，下调OCT4的效果；6利用实时荧光定量PCR和Western Blot方法检测下调MDA-MB-231细胞OCT4的表达后对EMT标志性分子E-cadherin和vimentin mRNA和蛋白表达水平的影响；7利用Transwell小室做侵袭和迁移实验检测下调MDA-MB-231细胞OCT4的表达后，对细胞侵袭和迁移能力的影响；8利用克隆形成实验检测下调MDA-MB-231细胞OCT4表达后，克隆形成能力的影响；9采用流式细胞术检测下调MDA-MB-231细胞OCT4表达后，细胞凋亡率和细胞周期分布情况。结果：1实时荧光定量PCR分析结果显示，在40例浸润性乳腺癌组织中，干细胞因子OCT4的mRNA表达与上皮标志物E-cadherin的mRNA表达成负相关（R=0.119，P＜0.05），与间质标志物vimentin的mRNA表达成正相关（R=0.245，P＜0.05），而E-cadherin mRNA表达与vimentin mRNA表达也呈负相关（R=0.227，P＜0.05）。2免疫组织化学分析结果显示，40例浸润性乳腺癌组织中，OCT4阳性率为30%（12/40），E-cadherin阳性率为55%（22/40），vimentin阳性率为65%（26/40）。OCT4表达与乳腺癌患者的年龄、组织学分级、淋巴结转移以及Her-2的表达有关，差异具有统计学意义（P＜0.05）。E-cadherin表达与淋巴结转移有关，差异具有统计学意义（P＜0.05），vimentin表达与组织学分级、淋巴结转移有关，差异具有统计学意义（P＜0.05）。OCT4表达与E-cadherin表达呈负相关（R=0.395，P＜0.05），与vimentin表达呈正相关（R=0.366，P＜0.05），而E-cadherin表达与vimentin表达也呈负相关（R=0.453，P＜0.05）。OCT4在转移性乳腺癌与未转移性乳腺癌之间的表达差异具有统计学意义（P＜0.05）。E-cadherin、vimentin在转移性乳腺癌和未转移的乳腺癌中的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。生存分析结果显示，OCT4阳性表达患者的生存率明显低于阴性表达患者，差异具有统计学意义（P＜0.05）。而E-cadherin和vimentin的表达与患者生存率之间未见明显相关性（P＞0.05）。3荧光显微镜观察病毒液感染效果，如Fig.1所示。流式细胞术检测病毒感染效率结果显示，100μl病毒液感染293T细胞时，control-shRNA-pLKO.3和OCT4-shRNA-pLKO.3的感染效率分别为22.6%、20.8%。200μl病毒液感染293T细胞时，control-shRNA-pLKO.3和OCT4-shRNA-pLKO.3的转染效率分别为54.9%、41.6%。500μl病毒液感染MDA-MB-231细胞， control-shRNA-pLKO.3和OCT4-shRNA-pLKO.3的转染效率分别为98.4%、86.1%。4实时荧光定量PCR、Western Blot分析结果显示，MDA-MB-231细胞中，感染OCT4-shRNA组的OCT4mRNA和蛋白表达水平明显低于parental组和control-shRNA组（P＜0.05）。同时检测下调OCT4基因表达后，EMT相关因子mRNA或蛋白的表达情况，分析结果显示，上皮标志物E-cadherin的mRNA和蛋白表达显著上调（P＜0.05），而间质标志物vimentin的表达显著下调（P＜0.05）。5Transwell分析结果显示，在乳腺癌细胞MDA-MB-231中，感染OCT4-shRNA组迁移和侵袭到下室的细胞数明显少于parental组和control-shRNA组（P＜0.05），说明下调OCT4基因表达明显抑制了MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力（P＜0.05）。6克隆形成实验结果显示，下调OCT4基因表达后，MDA-MB-231细胞中，parental组、control-shRNA组和OCT4-shRNA组的克隆数分别为344.55±29.67、318.20±23.22和102.65±9.87，OCT4-shRNA组与control-shRNA组相比克隆数显著降低（P＜0.05），与parental组相比克隆数也显著降低（P＜0.05），control-shRNA组与parental组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。7FCM检测细胞凋亡和细胞周期的变化，结果显示，与parental组和control-shRNA组相比，乳腺癌细胞系MDA-MB-231感染OCT4-shRNA后，细胞早期凋亡率显著增加（P＜0.05）。并且，下调MDA-MB-231细胞OCT4基因表达后，细胞周期阻滞于G1期。结论：OCT4在乳腺癌组织中的表达与上皮标志物E-cadherin的表达成负相关与间质标志物vimentin的表达成正相关，这就说明OCT4可能通过EMT促进了乳腺癌细胞的转移。OCT4基因的阳性表达是影响乳腺癌预后的独立因素。OCT4-shRNA质粒能够有效沉默OCT4基因的表达，可抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，将细胞周期阻滞在G1期，同时，EMT相关标志物E-cadherin表达上调，vimentin表达下调，结果提示OCT4介导的肿瘤发生与EMT的调控有关，OCT4可能成为临床一个新的治疗靶点。