研究背景:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是以侵蚀性、对称性多关节炎为主要临床表现的慢性、全身性自身免疫性疾病。成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLSs)过度活化及其迁移、侵袭能力增强,在关节软骨和骨破坏中发挥重要作用。因此,抑制其过度活化及迁移、侵袭能力对RA的治疗具有重要意义。RA属于中医痹证范畴,导师林昌松教授经长期理论研究和临床实践,总结出RA的基本病病机为“风湿瘀阻,筋伤骨损”,并提出“补肾祛湿通脉法”为RA的基本治疗原则,临床中运用专方断藤益母汤(Duanteng Yimu Decoction,DTYMD)治疗RA,取得较好的临床疗效,但其作用机制尚未阐明。课题组前期已就复方中相关单体,如益母草碱、山奈酚等对滑膜细胞功能的作用及机制进行研究,缺乏复方的系统研究。本课题为导师国自然面上项目“基于网络药理学的断藤益母汤治疗类风湿性关节炎的整合机制研究(项目编号:81573930)”的复方研究部分。本论文拟对断藤益母汤复方制剂的质量标准,复方对成纤维样滑膜细胞活化、迁移和侵袭功能作用及机制,复方对CIA小鼠模型的治疗作用等方面进行系统研究,为其临床应用提供科学依据。一、断藤益母汤质量标准的初步研究目的:1.初步构建断藤益母汤冻干粉薄层鉴定方法。2.初步构建断藤益母汤冻干粉指纹图谱。方法:水煎提取断藤益母汤有效成分,旋转蒸发仪浓缩,真空冷冻干燥机制备冻干粉。取断藤益母汤冻干粉制备供试品溶液,取昆明山海棠对照药材制备对照药材溶液,取雷公藤甲素制备对照品溶液,照薄层色谱法试验。取断藤益母汤冻干粉制备供试品溶液,取续断对照药材制备对照药材溶液,取川续断皂苷Ⅵ制备对照品溶液,照薄层色谱法试验。取断藤益母汤冻干粉制备供试品溶液,取益母草对照药材制备对照药材溶液,取盐酸水苏碱制备对照品溶液,照薄层色谱法试验。以上薄层色谱法均参照《中国药典》2015年版四部通则0502进行。取断藤益母汤冻干粉制备供试品溶液,连续进样6次,记录HPLC色谱图。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2012版进行评价,进行精密度试验;取断藤益母汤冻干粉制备供试品溶液,分别在0、2、4、6、8、10、24、48h进样,记录HPLC色谱图,采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2012版进行评价,进行稳定性试验;取断藤益母汤冻干粉制备供试品溶液,制备6份供试品溶液,进行检测,记录HPLC色谱图,采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2012版进行评价,进行重复性试验。通过以上精密度试验、稳定性试验、重复性试验进行方法学考察。重复性6个供试品色谱进行分析,找出共有峰、确定参照峰,并对部分峰进行归属分析。结果:构建昆明山海棠薄层色谱鉴别方法,所得色谱斑点清晰,在不同温度(8℃,20℃)、不同湿度(18%,72%)、不同厂家薄层板(德国Merck公司,TLC Silic gel 60;青岛海洋化工有限公司,硅胶G)等条件下,均能得到较好的分离效果。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。构建续断薄层色谱鉴别方法,所得色谱斑点清晰,且阴性对照无干扰,在不同温度下(8℃,27℃)、不同湿度(18%,57%)、不同厂家薄层板(德国Merck公司,TLC Silic gel 60;青岛海洋化工有限公司,硅胶G)等条件下,均能得到较好的分离效果。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。构建益母草薄层鉴别方法,曾参考《中国药典》2015年版一部290页益母草[鉴别]项下方法鉴别,但斑点不清晰,在查阅相关文献的基础上进行试验,改进鉴别方法。结果色谱斑点清晰,且阴性对照无干扰,在不同温度下(8℃,27℃)、不同湿度(18%,65%)、不同厂家薄层板(德国Merck公司,TLC Silic gel 60;青岛海洋化工有限公司,硅胶G)等条件下,均能得到较好的分离效果。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。精密度试验显示:连续6次进样,色谱指纹图谱相似度均大于0.99,表明仪器的精密度良好。稳定性试验显示:分别在0、2、4、6、8、10、24、48h进样,所得色谱指纹图谱相似度均大于0.99,结果表明供试品溶液放置48h内稳定。重复性试验结果显示:6份供试品溶液进行检测,色谱指纹图谱相似度均大于0.98,结果表明方法重复性好。通过精密度试验、稳定性试验、重复性试验,表明实验方法稳定可靠。色谱图分析结果:确定34个稳定出现的共有峰,其中34号峰川续断皂苷Ⅵ分离度高,稳定性好,故选择该峰为参照峰;色谱峰归属分析,其中3、4、5、8、9、11、14、18、19、20号峰属于昆明山海棠,6、7、12、28、29、30号峰属于续断,1、2、13、21、22、23、24、25、26、27、31 号峰属于益母草。结论:通过薄层色谱、指纹图谱技术,初步构建了断藤益母汤冻干粉质量标准。二、断藤益母汤对RA FLSs活化、迁移和侵袭调控作用研究目的:研究断藤益母汤对RA FLSs活化、迁移和侵袭的调控作用。方法:取进行膝关节关节镜检或关节置换患者的新鲜滑膜组织,按照课题组前期构建的培养方法进行原代培养,培养至3-6代进行后续实验。通过CCK-8实验,检测断藤益母汤对RA FLSs存活率的影响;分别采用elisa法、Reai Time PCR法,研究断藤益母汤对RA FLSs炎症因子IL-1 β、IL-6、IL-8和基质金属蛋白酶MMP1、MMP3、MMP9蛋白及mRNA表达水平的调控作用;采用transwell迁移板、Invasion板,研究断藤益母汤对RA FLSs迁移和侵袭功能的影响。结果:原代培养细胞光镜下观察,其形态符合FLSs特征。CCK-8结果显示:DTYMD 200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、800ug/ml浓度组,甲氨喋呤(MTX)10uM干预24h、48h对RA FLSs细胞活力均无明显影响;DTYMD 1200ug/ml组干预24h,及DTYMD 1000ug/ml干预48h均可显著抑制RA FLSs细胞活力(P<0.01)。因此选择200ug/ml、400ug/ml、800ug/ml分别作为DTYMD的低、中、高剂量组,MTX 10 uM作为阳性对照组,进行后续细胞实验。Elisa实验结果表明:TNF-α组,经TNF-α刺激后RA FLSs炎症因子IL-1 β、IL-6、IL-8和基质金属蛋白酶MMP1、MMP3、MMP9蛋白水平较空白对照组明显升高(P<0.01)。DTYMD低、中、高剂量组及MTX组均能显著下调炎症因子IL-1 β、IL-6、IL-8和基质金属蛋白酶MMP1、MMP3、MMP9蛋白表达水平。Reai Time PCR实验结果表明:TNF-α组,经TNF-α刺激后RA FLSs炎症因子IL-1 β、IL-6、IL-8和基质金属蛋白酶MMP1、MMP3、MMP9的mRNA水平较空白对照组明显升高(P<0.01)。DTYMD低、中、高剂量组及MTX组均能显著下调炎症因子IL-1 β、IL-6、IL-8和基质金属蛋白酶MMP1、MMP3、MMP9的mRNA表达水平。transwell迁移实验结果表明:与空白对照组相比,DTYMD低、中、高剂量组及MTX组均能降低RA FLSs的体外迁移能力(P<0.01)。Invasion侵袭实验结果表明:与空白对照组相比,DTYMD低、中、高剂量组及MTX组均能降低RA FLSs的穿过基质胶的能力(P<0.01)。结论:断藤益母汤可下调TNF-α诱导升高的炎症因子IL-1 β、IL-6、IL-8和基质金属蛋白酶MMP1、MMP3、MMP9的蛋白及mRNA表达水平。断藤益母汤对RA FLSs体外迁移和侵袭功能具有抑制作用。三、断藤益母汤对RA FLSs活化、迁移和侵袭调控作用分子机制研究目的:研究断藤益母汤对RA FLSs活化、迁移和侵袭调控作用分子机制。方法:采用免疫印迹法(western blot,WB)检测断藤益母汤对RA FLSs NFkB信号通路中p65、IKK α/β、IKBα磷酸化的的影响。采用Real Time　PCR法,研究NFkB抑制剂PDTC对RA FLSs炎症因子IL-1 β、IL-6、IL-8和基质金属蛋白酶MMP1、MMP3、MMP9的mRNA表达水平的调控作用。采用transwell迁移板、Invasion板,检测NFkB抑制剂PDTC对RA FLSs迁移、侵袭功能的影响。结果:免疫印迹法结果表明:经TNF-α刺激后,RA FLSs中p65、IKB α、IKK α+β磷酸化水平明显升高(P<0.01)。DTYMD低、中、高剂量组可显著下调由TNF-α诱导升高的p65和IKBα的磷酸化(P<0.01),而对TNF-α诱导升高的IKK α/β磷酸化无明显影响(P>0.05)。Reai Time PCR法检测表明:NFkB抑制剂可明显下调由TNF-a诱导升高的炎症因子IL-1 β、IL-6、IL-8和基质金属蛋白酶MMP1、MMP3、MMP9的mRNA表达水平(P<0.01)。transwell迁移实验、Invasion侵袭实验结果表明:NFkB抑制剂明显下调由TNF-α诱导而增强的RA FLSs迁移和侵袭能力。结论:断藤益母汤可以通过NFkB信号通路来调控RA FLSs的活化、迁移和侵袭。四、断藤益母汤对小鼠胶原诱导性关节炎的治疗作用目的:观察断藤益母汤对小鼠胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型的治疗作用。方法:选用DBA/1J小鼠,通过两次免疫法构建经典RA动物模型——小鼠胶原诱导型关节炎模型(CIA)。动物实验共48只,随机分为6组,分别为正常组、模型组、MTX组(2mg/kg)、DTYMD不同剂量组(7.5mg/kg,15mg/kg,30mg/kg)。除正常组外,其余五组均构建CIA模型。加强免疫后当天,各组即给予相应的干预。通过观察治疗前后小鼠一般情况、CIA小鼠踝关节肿胀程度及关节炎评分、HE染色及病理评分等指标,研究DTYMD对RA模型小鼠的治疗作用。通过计算CIA小鼠脾指数、睾丸指数,观察断藤益母汤对CIA小鼠免疫功能以及生殖系统的影响。结果:各组小鼠造模前一般状态良好,活泼好动,食欲正常,营养良好,被毛光泽,爪、鼻唇、耳色泽明润,二便正常。初次免疫后,造模小鼠尾部肿胀,部分有溃疡,甚至断尾,小鼠活动减少,活跃度下降,小鼠体重普遍开始下降,其中模型组与DTYMTD高剂量组体重下降较为明显。加强免疫后,模型组与DTYMD高剂量组小鼠大多被毛欠光泽,少动,其中DTYMD高剂量可明显观察到小鼠睾丸萎缩。通常小鼠于加强免疫1周左右开始陆续出现关节肿胀,前后肢均可出现肿胀。加强免疫后2周,大部分小鼠出现关节肿胀,之后仍陆续有小鼠出现关节肿胀。与正常组相比,模型组关节肿胀,严重者出现强直。与模型组相比,DTYMTD低、中、高剂量组及MTX组小鼠关节红肿较轻,关节活动尚可。本实验通过动态观察,评估DTYMD对小鼠前后肢关节炎评分的影响。给药后3周左右(day41),各组关节炎评分均有下降趋势。与模型组相比,给药2周(day33)时,DTYMD中、高剂量组及MTX组关节炎评分明显下降(P<0.05或P<0.01);给药2周以后各时间点(day37、day41、day45),DTYMD低、中、高剂量组及MTX组关节炎评分均较模型组显著下降(P<0.01)。关节病理结果显示:正常组小鼠踝关节结构完整,滑膜未见增生,未见炎症细胞浸润,关节软骨面光滑平整,无关节软骨及骨质破坏。模型组小鼠踝关节结构破坏炎症,炎症细胞浸润明显,血管翳形成向软骨内侵袭导致软骨及骨破坏。各治疗组踝关节关节相对完整,滑膜增厚不明显,少量炎症细胞浸润。与正常组相比,模型组关节周围炎症评分、软骨破坏评分和病理总评分明显升高(P<0.01)。与模型组比较,DTYMD各剂量组和MTX干预后,各项评分显著降低(P<0.01)。与正常组比较,模型组脾指数显著(P<0.01);与模型组比较,DTYMD低、中、高剂量组及MTX组脾指数显著下降(P<0.05或P<0.01)。与正常组比较,模型组睾丸指数无统计学差异;与模型组比较,DTYMD高剂量组睾丸指数均显著降低(P<0.01)。结论:断藤益母汤能有效缓解CIA小鼠关节肿胀,降低关节炎症评分,防止关节和骨质破坏,对RA小鼠模型具有确切的治疗作用。但是断藤益母汤高剂量组表现出一定的生殖抑制作用。