研究背景骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种目前普遍流行的给人类健康造成严重伤害的慢性退行性疾病,主要的表现特征为滑膜炎和软骨下骨的重建。近年来,全世界人口一直在急剧增加,人口老龄化的问题越来越突出,同时肥胖人口也在不断上升,因此OA的发病率也在年年攀升。关节软骨是透明软骨中的一种,无血管、淋巴引流及神经分布,其主要的组成成分为软骨细胞和细胞外基质。其中关节软骨中的唯一细胞一—软骨细胞,参与合成和调节ECM,在OA中起着非常重要的作用。大量研究表明,抑制软骨细胞凋亡和促进其增殖,可能是防控骨关节炎发病过程中的关键一环。大量研究表明,激素、药物、各种细胞和调节因子均能调控软骨细胞的分泌和合成。细胞外基质(主要包括蛋白聚糖和胶原蛋白)对软骨细胞的生长、分布、连接及修复有着重要的调节作用。胶原蛋白可以增强软骨组织的抗拉能力,而蛋白聚糖则可以维持ECM中的水分子,助其分散软骨组织的负荷和防御外来压力。整合素是一种具有重要作用的表面粘附受体,其主要功能是介导细胞和细胞外基质之间的关联粘附,参与调节众多细胞的各种生理过程,包括增殖、生长、分化、粘附、和凋亡等。软骨细胞中可见不同种类的整合素表达,而骨骼系统的主要表达种类是β链。整合素在软骨细胞中,通过调节和激活下游蛋白受体而进行力学信号传导,从而对软骨细胞的分化、增殖和凋亡进行调节。在软骨细胞中,整合素能够传导机械力刺激以及软骨细胞内的信号,来调节软骨细胞的基因表达及功能。软骨细胞中的整合素和四周的ECM相互作用,这种作用可能和细胞ECM的再生、软骨细胞的生长分化有关。生理条件下,软骨组织的合成和分解维持着动态平衡,而对骨关节炎中关节软骨的实验性研究结果指出,OA的发病主要是因为软骨组织的合成与降解之间的平衡关系被破坏。与此同时,目前研究表明GIT1与整合素之间存在一定的作用关系。GIT1可与多种细胞因子和细胞表面蛋白互相作用,从而在细胞的生长迁移中发挥着关键的作用。目前,GIT1在骨细胞中的研究已有一定进展,研究比较多的是破骨细胞和成骨细胞,两种细胞都能表达GIT1。在成骨细胞中GIT1具有调控细胞迁移的作用,从而对骨愈合具有调控作用。目前研究均证明GIT1蛋白在骨生长发育中具有重要作用,可以对细胞骨架进行调控而发挥其功能,并且自身也是一种支架蛋白,从而进行各种信号传导。但是到目前为止,GIT1对软骨细胞的作用研究还很少,且整合素β1和GIT1之间的调控关系尚未明确,有研究指出,GIT1可能是整合素传导控制通路下游的一个重要蛋白分子。研究目的因此本研究通过建立骨关节炎模型,主要探讨整合素β1和GIT1对软骨细胞的影响,及二者之间的调控关系。以便对临床上骨性关节炎的治疗起指导作用。研究方法：1、本次研究,我们采用约一周龄的年乳大鼠20只,雌雄不限。用Hulth法建立骨关节炎模型,进行关节软骨细胞的分离获取,一步消化法(Ⅱ型胶原酶)处理骨关节炎大鼠的关节软骨细胞,分离软骨细胞后进行传代培养。采用Trizol法提取关节软骨细胞总RNA,并采用PCR技术扩增integrin-β1和GIT1编码区,用Kpn Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切克隆到pcDNA3.1载体上。然后通过RNAi实验抑制integrin-β1的表达。分别采用定量PCR和Western Blotting检测对照组、pcDNA3.1空载体转染组、pcDNA3.1-GIT1过表达组、pcDN A3.1-integrin-β1过表达组、integrin-β1 siRNA组和NC siRNA组中,integrin-β1和GIT1的mRNA和蛋白质的表达水平,来判断integrin-β1和GIT1之间的调控关系。2、取第一代的骨关节炎软骨细胞进一步培养,分别采用定量PCR和Western Blotting检测对照组、pcDNA3.1空载体转染组、pcDNA3.1-GIT1过表达载体转染组、pcDNA3.1-integrin-β1过表达载体转染组、integrin-β1 siRNA转染组和NCsiRNA转染组中Ⅱ型胶原蛋白和蛋白多糖的表达。分别采用BrdU法和TUNEL-DAPI检测软骨细胞的增殖和凋亡现象。研究结果1、荧光定量PCR实验表明,转染integrin β1-siRNA后,敲除integrin β1的表达时,GIT1 mRNA的表达水平相应下降,而过表达integrin β1时,GIT1 mRNA的表达水平显著上调,与对照组进行比较,具有统计学差异意义(P<0.05)；然而提高GIT1的表达后,integrin β1 mRNA的表达水平不受影响。采用蛋白免疫印迹法检测后,蛋白表达水平和基因表达水平相似。敲除integrin (31后,GIT1的蛋白表达水平随之降低,提高integrin β1的表达时,GIT1的蛋白表达水平上调显著,与对照组进行比较,具有统计学差异意义(P<0.05)。而GIT1过表达时,integrin β1蛋白水平不会受到干扰。2、对软骨细胞采用integrin-β1 siRNA和NC siRNA转染,培育48个小时后,用Brdu法检测发现,对照组、pcDNA3.1组、pcDNA3.1-GIT1组pcDNA3.1-integrin-β1组、integrin-β1 siRNA组和NC siRNA组之间,骨关节炎软骨细胞的增值率差异有统计学意义(P<0.01)。integrin-β1和GIT1的过表达可以提高软骨细胞的增值率用荧光定量PCR和蛋白免疫印迹检测技术分析发现,Aggrecan、type Ⅱ Collagen的mRNA和蛋白表达水平在pcDNA3.1-GIT1组、pcDNA3.1-integrin-β1组最高,抑制integrin-β1的表达后,二者的蛋白表达水平明显下调,差异有统计学意义(P<0.05)。采用TUNEL-DAPI分析法检测DNA断裂情况,从而确定软骨细胞凋亡的高低。结果显示,integrin-β1的过表达明显抑制了软骨细胞的凋亡而当抑制integrin-β1的表达时,并没有发现对软骨细胞的凋亡有明显的影响。结论在体外骨关节炎关节软骨细胞模型中发现,integrin-β1和GIT1均能促进软骨细胞的增殖,并抑制其凋亡发生。integrin-β1的过表达可以提高GIT1的表达,反过来,GIT1的高表达对integrin-β1没有影响,说明integrin-β1可以调控GIT1的表达,GTI1可能是位于integrin-β1下游的一个关键分子。