血凝素(HA)是禽流感病毒的主要保护性抗原,神经氨酸酶(NA)是AIV表面仅次于HA的一种重要抗原,为分析HA、NA基因的遗传进化关系,探求毒株致病力差异的分子基础,本研究对禽流感病毒分离毒株血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)基因进行了RT-PCR扩增,并对其克隆、测序。测序结果表明,克隆到的HA基因包含完整的开放读码框,基因全长1707bp,编码568个氨基酸,其中信号肽1-16个氨基酸,HA1 330个氨基酸(内含裂解位点5-6个碱性氨基酸),HA2 222个氨基酸,并含有起始密码子和终止密码子;NA基因全长1410bp ,编码469个氨基酸。提取Genbank中发表的禽流感H5N1参考毒株序列,进行序列分析和同源性比对,结果发现,HA核苷酸序列同源性在91.0%-98.7%之间,变异较大,说明禽流感病毒随着时间的推移不断进行着基因重组、突变。NA基因在进化上相对保守,序列同源性在95.2%以上。为研制新型重组疫苗,马立克病毒作为重组病毒活载体的基因工程疫苗已成为研究重点。转移载体的构建是重组马立克病毒构建的重要环节。在分析马立克病毒基因组的基础上,以US2基因为插入位点,设计引物扩增2.6 kb的同源臂,将扩增后的同源臂在体外连接后,插入到pUC18中,并且以此为基础,构建表达绿色荧光蛋白的转移通用载体。含有eGFP的转移载体转染马立克病毒感染的鸡胚成纤维细胞后,报告基因获得表达,这将为马立克病毒载体系统的进一步开发奠定基础。本研究为克服当前禽流感灭活疫苗交叉保护力低的弱点,拟构建表达禽流感病毒HA和NA基因的重组马立克病毒,以期研制新型具有交叉保护力的重组病毒疫苗。将AIV的血凝素蛋白(HA)基因插入到MDV通用转移载体中,构建能单独表达HA蛋白的rMDV转移载体;同时又将AIV HA基因和NA基因克隆到MDV通用转移载体,构建含有HA-NA两种基因的转移载体。利用脂质体介导的方法将转移载体转染由亲本马立克病毒CVI988感染的鸡胚成纤维细胞。依据绿色荧光蛋白(GFP)标记基因在细胞中是否表达,筛选重组病毒,经数轮蚀斑纯化,PCR鉴定结果证明所获得的重组病毒rMDV-HA-NA遗传性状稳定,并能够对其重组的单个或两个外源基因进行高效表达,且在培养细胞中的表达产物具有与AIV蛋白相似的生物学特性及免疫学活性。本实验为下一步的重组马立克疫苗的研制提供了必要的实验依据。总之,通过本研究构建了重组马立克病毒通用转移质粒,为重组疫苗的研制提供了材料基础。同时,初步获得了一株能同时表达禽流感HA、NA的重组马立克病毒,这将对新型基因工程疫苗的研制,为禽流感的防治带来新的技术。