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高分子量谷蛋白亚基(High molecular weight glutenin subunit, HMW-GS)是小麦籽粒贮藏蛋白的重要组分,其组成和含量直接影响小麦面粉的加工品质。栽培一粒小麦(Triticum monococcum, AA,2n=2x=14)和野生二粒小麦(T. dicoccoides, AABB, 2n=4x=28)基因组与普通小麦的相应基因组同源,并且蕴藏着丰富的HMW-GS等位变异,因此,其特异HMW-GS基因的分离与鉴定,既能为普通小麦品质改良提供有价值的基因资源,也能为HMW-GS基因的起源与进化提供有用的分子信息。本研究以栽培一粒小麦和野生二粒小麦为材料分离鉴定了6个新的HMW-GS基因,并进行了序列比较、原核表达、蛋白二级结构预测、系统进化分析。在此基础上,以一份野生二粒小麦为代表,初步探讨了其HMW-GS基因在普通小麦中的利用潜能。主要研究结果如下：1.利用SDS-PAGE技术从两份栽培一粒小麦P1560720和P1345186中鉴定出两个活性的1Ay型高分子量谷蛋白亚基,1Ay12*和1Ay8*,其电泳迁移率分别类似于普通小麦“中国春”的1Dy12和1By8亚基。分子克隆和序列分析显示,1Ay12*和1Ay8*的开放阅读框(open reading frame, ORF)分别包含1812 bp和1935 bp,编码602和643个氨基酸残基,与它们最相似的活性1Ay等位基因相比,1Ay12*和1Ay8*中共鉴定出15个单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphism, SNP)和2个插入或缺失(insertion or a deletion, InDel)区段。其编码功能通过原核表达得以进一步确认。通过与GenBank数据库中已有1Ay等位基因序列详细的比较分析,我们将1Ay等位基因划分成两个组：Cys-型和Phe-型。这两种类型1Ay等位基因的主要区别在于它们编码亚基-73位的氨基酸残基不同,分别为半胱氨酸残基(Cys)和苯丙氨酸残基(Phe)。本研究所克隆的两个活性1Ay基因1Ay12*和1Ay8*分别属于Phe-型和Cys-型。其中,1Ay8*亚基不仅在其中央重复区拥有一个Phe-型1Ay亚基所没有的额外的半胱氨酸残基,而且是已知的第二大的1Ay亚基,表明栽培一粒小麦P1345186中的1Ay8*很可能能够增强面筋蛋白聚合体之间的相互作用,对小麦面包加工品质产生正效应,是小麦品质改良的重要基因资源。2.从一份来自以色列的野生二粒小麦D129中克隆到一个嵌合型的HMW-GS基因,ChAy/Bx。SDS-PAGE分析显示,ChAy/Bx所编码蛋白的电泳迁移率快于普通小麦“中国春”的1Dy12亚基。ChAy/Bx基因的开放阅读框(ORF)大小为1671 bp,其编码的成熟亚基包含534个氨基酸残基。据我们所知,这是目前从小麦属物种中所鉴定到的最小的高分子量谷蛋白亚基。序列分析表明,ChAy/Bx基因的前1305 nt的序列与1Ay类基因的相应序列高度同源,而末尾的366nt序列却与1Bx类基因的相应序列高度同源。所以,ChAy/Bx基因并不是传统意义上的1Ay类基因或1Bx类基因,而是一个新型的嵌合基因。成熟的ChAy/Bx亚基,其前部的414个氨基酸残基(从N-末端区开始一直到中央重复区的近末端部分)与1Ay亚基同源,而后部的120个氨基酸残基(包括剩余的中央重复区和整个C-末端区)与1Bx亚基同源。预测的二级结构显示,ChAy/Bx亚基的C-末端区存在两个额外的且同于1Bx亚基KC167177的α螺旋结构,比其最相似的1Ay亚基JF519636,缺少一个β折叠结构但多一个α螺旋结构,表明ChAy/Bx亚基的嵌合型序列已经影响其二级结构。据此推测,ChAy/Bx亚基特殊的一级和二级结构也可能进一步影响其高级结构和面粉加工品质效应。同时,我们认为部分同源重组导致了ChAy/Bx的形成,这可能是HMW-GS基因等位变异产生和进化的一种新机制。ChAy/Bx基因是迄今被发现的第一个通过位于不同染色体组上的HMW-GS编码基因之间发生遗传重组所产生的嵌合型HMW-GS基因。3.从野生二粒小麦D141中分离并鉴定了3个新的HMW-GS基因：1Ax、1Bx13.1和1By16.1。其中,1Ax基因的编码区全长为2496 bp,但其835-837位存在提前终止密码子(TGA)导致该基因是一个不表达蛋白的假基因。我们在前期工作中,已从该材料分离并鉴定出1个具有编码活性的1Ay基因,据此确认,野生二粒小麦D141的Glu-A1位点仅编码1个高分子量谷蛋白亚基1Ay,而不编码1Ax亚基。这是迄今第一例通过分子水平鉴定到的只编码1Ay亚基的Glu-A1等位变异。该Glu-A1等位变异为排除紧密连锁于1Ay的lAx干扰,而单独探讨1Ay的面粉品质效应提供了极大便利,是进行1Ay品质效应研究的理想基因资源。1Bx13.1编码区全长2373 bp,推测其编码一个789个氨基酸残基的多肽(或者768个氨基酸残基的成熟蛋白)；1By16.1基因编码区全长2157 bp,推测其编码一个717个氨基酸残基的多肽(或者696个氨基酸残基的成熟蛋白)。1Bx13.1+1By16.1在SDS-PAGE上的迁移率与来自普通小麦的优质亚基组合1Bx13+1By16最接近。二级结构预测表明,1Bx13.1亚基在N-末端区和C-末端区较1Bx13亚基含有更多的α-螺旋；1By16.1亚基的α-螺旋也较1By16亚基的a-螺旋含有更多氨基酸残基。推测其亚基组合1Bx13.1+1By16.1可能较来自普通小麦的优质亚基组合1Bx13+1By16对小麦面包加工品质有更好的效应,具有较大的育种利用价值。通过对普通小麦与野生二粒小麦D141杂交的F1和F2代籽粒的HMW-GS组成分析发现,其杂种后代籽粒中均检测到了来自野生二粒小麦D141的高分子量谷蛋白亚基或亚基组合,表明通过远缘杂交的染色体工程方法,将野生二粒小麦D141的HMW-GS基因转入普通小麦是可能的。