【摘 要】
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DNA甲基化是动植物基因组中最常见的表观遗传修饰,它能够调节基因转录,并对细胞分化、胚胎发育、对环境适应性以及病情发展都起着重大影响。马氏珠母贝是我国生产海水珍珠的主要贝类,本研究通过转录组和血清免疫指标的检测分析DNA甲基化的改变对马氏珠母贝免疫系统的影响,利用全基因组重亚硫酸盐测序（Whole Genome Bisulfite Sequencing,WGBS）技术获得植核免疫关键甲基化位点,并
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DNA甲基化是动植物基因组中最常见的表观遗传修饰,它能够调节基因转录,并对细胞分化、胚胎发育、对环境适应性以及病情发展都起着重大影响。马氏珠母贝是我国生产海水珍珠的主要贝类,本研究通过转录组和血清免疫指标的检测分析DNA甲基化的改变对马氏珠母贝免疫系统的影响,利用全基因组重亚硫酸盐测序（Whole Genome Bisulfite Sequencing,WGBS）技术获得植核免疫关键甲基化位点,并对其进行验证和功能分析。主要结果如下:1、DNA甲基化的改变对马氏珠母贝免疫系统的影响:利用DNA甲基转移酶抑制剂（Decitabine,DAC）处理马氏珠母贝,全基因组甲基化率检测说明,与对照组（PBS处理）相比,DAC可以显著降低马氏珠母贝血细胞全基因组甲基化修饰水平。转录组分析表明,DAC处理可以产生518个差异表达基因（DMGs）,这些DMGs主要富集在Notch和NF-κB等信号通路,其相关基因的表达水平在DAC刺激后上调。免疫指标检测表明,与对照组相比,DAC处理可以导致血清中超氧化物歧化酶（SOD）、白细胞介素-17（IL-17）、酚氧化酶（PO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）显著上升,并且血清的抑菌效果更加明显。说明DAC可以降低马氏贝全基因组甲基化修饰,激活免疫相关基因的表达,并从细胞免疫和体液免疫层面激活免疫系统。2、DNA甲基化在马氏珠母贝植核免疫中的作用:利用WGBS技术分析了马氏珠母贝植核前后不同时间点的血细胞DNA甲基化组,包括对照组、术前处理组、植核后8个时间点（6 h、12 h、1 d、3 d、6 d、12 d、18 d和30 d）。结果表明,马氏珠母贝血细胞基因组DNA中C碱基的甲基化率为2.37%-2.74%,主要位于CG二核苷酸中的C碱基,基因组中12.15%-14.12%的CG被甲基化,植核后6 h的CG甲基化比例最低;通过对基因组转录和调控元件的甲基化水平分析表明,m RNA和重复序列甲基化水平最高（14.73%-19.46%和24.24%-26.17%）,启动子和Cp G岛的甲基化水平最低（12.14%-13.98%和4.16%-6.06%）;CG类型和非CG类型甲基化位点的上游序列都存在对胸腺嘧啶（T）的偏好性,紧邻着非CG类型甲基化位点的下游碱基中出现最多的是腺嘌呤（A）。通过差异甲基化区域（DMR）分析表明,与对照组相比,术前处理可以产生51970个DMR,植核后不同时间点可以产生44359-68799个DMR,其中植核后6 h的DMR最多。DMR所在基因显著富集于细胞过程、代谢过程、分子功能中的粘合和活性催化（P＜0.05）,以及Fanconi anemia pathway和EpsteinBarr virus infection等免疫和细胞增殖相关的信号通路（P＜0.05）。3、启动子DNA甲基化的验证与功能分析:利用焦磷酸测序技术验证了凋亡蛋白酶活化因子1（APAF1）启动子的甲基化修饰水平,利用重亚硫酸盐测序（bisulfite sequencing,BSP）技术验证了n ACh R基因启动子的甲基化修饰水平,结果显示这两个基因的启动子在植核后6 h发生去甲基化,与WGBS结果基本吻合。转录因子预测结果显示APAF1基因启动子甲基化修饰区域具有启动子活性位点,n ACh R基因启动子甲基化修饰区域含有转录因子SP1、AP-1和NF-κB的结合位点;通过双荧光素酶报告技术分析启动子甲基化修饰区域的缺失对启动子活性的影响,结果显示甲基化修饰区域的缺失会导致n ACh R启动子活性显著升高,但对APAF1启动子的活性没有显著影响。根据n ACh R启动子甲基化修饰区域的序列特征设计探针（甲基化和非甲基化探针）,利用DNA pull-down技术分析DNA甲基化修饰对转录因子结合的影响,结果显示甲基化和非甲基化探针都可以检测到AP-2复合体亚基α（AP-2α）和AP-1复合体亚基γ（AP-1γ）,而非甲基化探针仅检测到AP-2α,表明甲基化修饰可能通过结合AP-1γ和AP-2α调控n ACh R启动子的活性。
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