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本文从以下几个部分展开论述: 第一部分 背景: 肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是最常见的原发性肝癌,也是全世界重大医学问题之一。肝癌的发生发展存在明显的性别差差异。肝癌性别差异的相关研究发现与性激素、炎性因子等密切相关,然而肝癌相关激素治疗并未能取得理想的效果。因此,肝癌发生的性别差异机制仍需要进一步深入研究。 目的: 1.探索雌激素对肝癌细胞增殖作用的影响。 2.探索雌激素影响肝癌细胞增殖作用的相关机制。 方法: 1.CCK-8实验检测不同浓度雌激素处理24h或实验浓度雌激素处理0,6,12,24,48h肝癌细胞的增殖情况;集落形成实验检测不同浓度雌激素处理肝癌细胞的集落形成情况。 2.用Lipofectamine2000试剂进行miRNA mimics和inhibitor转染,上调miR-125b或下调miR-125b。 3.相应实验处理后,Western Blot检测相关蛋白的表达,实时荧光定量PCR方法检测miR-125b和U6的表达。 结果: 1.雌激素药物浓度0.1μM及以上时SMMC-7721和Hep-G2细胞增殖受到抑制,具有一定浓度依赖性;雌激素(0.1μM)孵育0,6,12,24,48h,发现细胞增殖明显抑制,并具有一定时间依赖性。SMMC-7721和Hep-G2在雌激素处理后p-AKT表达明显下调;而T-AKT表达无明显变化。增殖和凋亡相关蛋白如Bcl-2,CyclinD1表达降低。发现雌激素(0.1μM)和AKT抑制剂(MK22061μM)处理后细胞增殖明显抑制,p-AKT水平明显降低。雌激素(0.1μM)同时加入激活剂(SC790.1μM)时细胞抑制现象消失,p-AKT水平升高,较正常组无明显差异。 2.通过荧光PCR检测发现,雌激素可上调miR-125b表达。通过转染miR-125b mimics发现细胞增殖被抑制,p-AKT水平降低。雌激素处理同时转染miR-125b inhibitor,雌激素抑制肝癌增殖现象被逆转。 结论: 雌激素通过上调miR-125b抑制AKT磷酸化进而抑制肝癌细胞的增殖。 第二部分 背景: 肝移植是肝癌合并肝衰竭最佳治疗方法,然而术后肝癌复发与转移是影响肝癌肝移植预后的重要因素。雷帕霉素是如今肝癌肝移植术后常用免疫抑制剂之一,又是mTOR抑制剂;发挥免疫抑制作用的同时,还有抑癌作用。然而,研究发现mTOR靶向治疗并未达到预期结果,主要原因是雷帕霉素等mTOR抑制剂可以负反馈调节AKT的磷酸化。 目的: 1.探索雷帕霉素对肝癌细胞增殖作用的影响。 2.探索雌激素增强雷帕霉素抑制肝癌细胞增殖作用的相关机制。 方法: 1.集落形成实验检测不同浓度雷帕霉素处理肝癌细胞的集落形成情况;CCK-8实验检测雌激素、雷帕霉素或两者联合处理肝癌细胞的增殖情况;肿瘤球形成实验观察雌激素、雷帕霉素或两者联合处理肝癌细胞的成球情况。 2.用Lipofectamine2000试剂进行miRNA mimics和inhibitor转染,上调miR-125b或抑制miR-125b。Western Blot检测相应实验处理后相关蛋白的表达。 结果: 1.雷帕霉素抑制SMMC-7721和Hep-G2细胞的增殖具有浓度依耐性。SMMC-7721和Hep-G2在雷帕霉素及雌激素联合处理时抑制细胞增殖更加明显。通过无血清培养基成球技术,发现雷帕霉素和雌激素抑制肝癌细胞SMMC-7721和Hep-G2的成球,雷帕霉素联合雌激素时,成球能力较单独雷帕霉素和雌激素明显降低。 2.雷帕霉素处理时出现负反馈AKT磷酸化的升高。雷帕霉素联合雌激素处理时,发现雌激素可部分抑制雷帕霉素负反馈AKT磷酸化的升高。雷帕霉素处理同时转染miR-125b mimics也可降低雷帕霉素负反馈AKT磷酸化的升高。 结论: 雌激素通过下调AKT磷酸化进而协同雷帕霉素抑制肝癌细胞的增殖。