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第一部分:LIMK1/P-LIMK1在无镁癫痫模型原代海马神经元及戊四氮癫痫模型大鼠脑组织中的表达测定目的:癫痫发生发展中的重要病理改变是神经元突触重塑及病理性放电环路的形成,我们通过文献了解,LIMK1在神经元突触重塑过程中起到十分重要的作用。本实验主要通过无镁诱导的癫痫海马神经元及戊四氮点燃的癫痫模型大鼠脑组织标本中检测LIMK1及其磷酸化形式P-LIMK1表达情况,探索LIMK1及P-LIMK1是否与癫痫活动相关。方法:1.选取新生24小时以内的Sprague Dawley(SD)大鼠,取其海马神经元进行体外培养,原代培养至第10天时使用无镁细胞外液诱导神经元痫样放电,对照组使用有镁细胞外液,细胞癫痫模型建立成功组被选作无镁癫痫组。2.在动物实验部分我们将250g左右雄性大鼠Sprague Dawley(SD)分成数量相等的两组:戊四氮癫痫实验组和生理盐水对照组,两组大鼠分别给予腹腔内注射戊四氮或生理盐水,并根据Racines分级,其中达到痫性惊厥的四级或五级的大鼠选进戊四氮癫痫实验组。3.使用蛋白印迹技术、免疫荧光技术检测LIMK1及P-LIMK1在无镁癫痫模型的原代海马神经元及戊四氮慢性癫痫模型大鼠脑组织中的表达变化。结果:1.LIMK1及P-LIMK1在无镁癫痫模型的原代海马神经元中有较丰富的表达,且主要表达在神经元细胞的胞浆和胞膜中。2.与对照组比较,无镁细胞癫痫模型中的LIMK1及P-LIMK1表达水平较对照组显著升高(p<0.05)。3.与注射生理盐水的对照组大鼠海马组织比较,注射戊四氮的癫痫模型大鼠中LIMK1及P-LIMK1表达水平显著升高(p<0.05)。结论:LIMK1及P-LIMK1主要表达在神经元细胞的胞浆和胞膜中。在无镁细胞外液诱导的体外癫痫模型及戊四氮诱导的体内慢性癫痫模型中,LIMK1及P-LIMK1的表达水平较对照组均明显上调,说明LIMK1及P-LIMK1表达和癫痫的发生发展可能密切相关,并发挥了一定的作用。第二部分:LIMK1对戊四氮癫痫模型大鼠行为学及无镁癫痫模型原代海马神经元突触重塑影响目的:为确定LIMK1在癫痫中的影响,我们在戊四氮癫痫大鼠中通过颅内转染慢病毒载体干预LIMK1的表达,研究其对慢性癫痫大鼠行为学的影响。在原代培养海马癫痫神经元中通过干预LIMK1的表达,研究神经元骨架蛋白Actin的表达变化,同时观察其对神经元树突棘的形态学的影响。方法:1.由上海吉玛公司设计并构建了含有下调LIMK1的慢病毒载体(LIMK1-RNAi),及空白对照慢病毒载体(CON-RNAi)。将重约140g-160g大鼠分为两组进行颅内海马DG(Dentate Gyrus)区定位注射慢病毒载体,实验组注射LIMK1-RNAi慢病毒载体,对照组注射CON-RNAi慢病毒载体。最后通过蛋白印迹技术验证LIMK1是否转染成功。2.病毒注射2周后,每日定时给予两组大鼠腹腔注射戊四氮(35mg/kg)并持续28天,注射戊四氮过程中观察大鼠行为30分钟,并根据Racines分级将大鼠第一次出现四或五级痫性发作的时间、痫性发作持续的总时间以及达到四或五级痫性发作次数统计并记录。3.将构建的慢病毒转入原代神经元中,通过免疫印迹和免疫荧光技术验证LIMK1转染成功率;同时验证下调LIMK1对此通路中相关蛋白活性影响。4.提取原代海马神经元中丝状肌动蛋白(F-actin)和球状肌动蛋白(G-actin),用蛋白印迹实验测定两者的灰度强度值,并取其平均值求F-actin/G-actin的值。5.免疫荧光技术检测法在体外培养的原代神经元无镁无镁模型中测定LIMK1下调对神经元突出重塑的影响。结果:1.大鼠海马DG区转染干预慢病毒载体后,免疫印迹实验结果提示,LIMK1的表达水平与CON-RNAi对照组相比明显下降(P<0.05)。2.注射LIMK1-RNAi慢病毒载体的戊四氮癫痫大鼠中,第一次达到四或五级癫痫性抽搐的时间较对照组显著延长,同时达到四或五级癫痫性抽搐时的总持续时间较对照组显著减少,四或五级癫痫性抽搐的总次数较对照组显著减少(P<0.05)。3.经过慢病毒转染神经元测试,得出LIMK1-RNAi慢病毒载体最佳感染复数(MOI)=6,以此感染复数转染神经元后,经蛋白印迹实验得出LIMK1表达被显著下调,且神经元以此感染复数转染后,生长未受影响。且LIMK1表达下调后LIMK1对此通路中的Rock-2、PAKs、LIMK2、和cofilin蛋白活性水平无影响。4.在无镁癫痫模型原代神经元中,F-actin/G-actin的比值较对照组显著增高,表明在体外癫痫模型中肌动蛋白的聚合显着增加。在敲低LIMK1的原代神经元实验组中较对照组(Con-RNAi),且两组均用无镁细胞外液诱导细胞癫痫模型后,我们发现F-actin/G-actin的比值较对照组显着降低。5.在无镁癫痫模型的原代神经元中,正常功能树突棘的比例和树突棘密度明显降低,在无镁癫痫原代神经元中下调LIMK1的表达,树突棘的密度和成熟树突棘的比例明显升高。结论:1.LIMK1-RNAi慢病毒载体可以成功敲低原代海马神经元和SD大鼠海马DG区神经元中LIMK1的表达水平;在原代培养的海马神经元中,LIMK1表达水平的降低没有影响其上、下游相关蛋白Rock-2、NR1和GluR1等活性。2.敲低LIMK1水平可以降低大鼠癫痫发作的易感性。3.LIMK1可能通过调节肌动蛋白聚合影响癫痫发作。4.在无镁细胞外液诱导的癫痫模型的海马神经元中,抑制LIMK1树突棘密度密度明显增加,且成熟棘突比例显著升高,证明LIMK1在癫痫发作时参与突触重塑病理过程。