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磷对家禽生产至关重要,不仅能促进骨骼的正常生长发育,还能保证良好的蛋壳品质。作为骨源性激素,成纤维细胞生长因子23(Fibroblast growth factor 23,FGF23)能够抑制哺乳动物肾脏中磷酸盐的重吸收,促进磷酸盐的排出,是机体内调控磷代谢的关键因子。因此研究FGF23如何调控家禽磷代谢及其骨骼发育,对深入了解FGF23作用机制以及生产实践有重要意义。本论文研究了影响鸡成骨细胞FGF23 mRNA表达的因素以及过表达FGF23腺病毒对成骨细胞矿化的影响,初步确定了FGF23在调控鸡成骨细胞矿化的中的作用。1.调控鸡成骨细胞FGF23表达的因素分析体外培养鸡骨髓间充质干细胞(Bone marrow stem cells,BMSCs),并诱导其分化为成骨细胞。在诱导细胞分化的第8天,使用茜素红S染色,可以观察到大量红色矿化结节,表明大多BMSCs已经被诱导分化为成骨细胞。为了探究影响成骨细胞FGF23表达的因素,使用β-甘油磷酸钠(β-glycerol phosphate disodium salt,β-Gly,5mM、10M、20mM)、氯化钙(Calcium chloride,CaCl2,5mM、10M、20mM)、1,25二羟基维生素D3(1,25-Dihydroxyvitamin D3,1,25(OH)2D3,10-9M、10-8M、10-7M)、甲状旁腺激素(Parathyroid hormone,PTH,10-9M、10-8M、10-7M)处理48h。结果显示,β-Gly、CaCl2及10-9M 1,25(OH)2D3对成骨细胞FGF23 mRNA表达有显著的抑制作用(P<0.001);10-8M 1,25(OH)2D3对成骨细胞FGF23 mRNA表达无影响,而10-7M 1,25(OH)2D3及PTH均显著上调了成骨细胞FGF23 mRNA表达(P<0.001)。1,25(OH)2D3和PTH对成骨细胞FGF23 mRNA表达的影响与先前在哺乳动物上的报道结果一致,而β-Gly、CaCl2对成骨细胞FGF23 mRNA表达的影响与哺乳动物不同。2.钙、磷、维生素D对分化阶段成骨细胞的影响在诱导BMSCs向成骨细胞分化的同时,进行β-Gly(5mM)、CaCl2(5mM)以及1,25(OH)2D3(10-7M)处理,探究钙磷和维生素D(Vitamin D,VD)对成骨细胞FGF23表达及其矿化的影响。转录水平上的检测基因包括:FGF23;Runx家族转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2);碱性磷酸酶(Alkaline phosphorus,ALP);调控焦磷酸盐(Pyrophosphate,PPi)生成的基因胞外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1(Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1,ENPP1)、胞外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶3(Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 3,ENPP3);调控PPi从胞内转运至胞外的焦磷酸盐转运体(Progressive ankylosis,ANK);调控PPi分解的基因组织非特异性碱性磷酸酶(Tissue non-specific alkaline phosphatase,TNAP);骨桥蛋白(Osteopontin,OPN);磷酸调节中性内肽酶(Phosphate-regulating neutral endopeptidase,PHEX)。结果表明,5mMβ-Gly处理显著上调成骨细胞ALP和ENPP3 mRNA表达(P<0.05),显著抑制FGF23、Runx2、ENPP1、ANK、TNAP、OPN及PHEX等mRNA表达(P<0.05)。5mM CaCl2处理显著上调成骨细胞FGF23、Runx2、ALP、ENPP1、ANK、OPN及PHEX等mRNA表达(P<0.05),显著抑制ENPP3和TNAP mRNA表达(P<0.05)。10-7M1,25(OH)2D3处理显著上调成骨细胞FGF23、ALP、ENPP1、ANK、OPN、PHEX及VDR等mRNA表达(P<0.05),显著抑制TNAP mRNA表达(P<0.05),10-7M 1,25(OH)2D3处理对Runx2和ENPP3 mRNA表达无影响,茜素红染色结果显示,10-7M 1,25(OH)2D3处理显著减少了矿化结节的数量(P<0.05),检测细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)及其磷酸化蛋白表达水平发现,10-7M 1,25(OH)2D3处理使P-ERK及P-ERK/ERK蛋白表达水平显著上调(P<0.05)。以上结果证实,对于分化阶段的成骨细胞,5mMβ-Gly处理显著抑制FGF23以及与PPi胞内沉积相关的mRNA表达;5mM CaCl2处理显著促进FGF23以及与PPi胞内沉积相关的mRNA表达;10-7M 1,25(OH)2D3显著上调FGF23以及与PPi胞内沉积相关的mRNA表达,显著抑制成骨细胞矿化,ERK信号通路参与了1,25(OH)2D3的调控作用。3.FGF23对成骨细胞的直接作用及其机制研究为探究FGF23对成骨细胞分化矿化的直接作用,我们在成骨细胞生长的不同阶段过表达FGF23腺病毒(Adv-FGF23,107 pfu/mL)。并使用FGF/VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂(50 nM)阻断FGF受体3(Fibroblast growth factor receptor 3,FGFR3),探究FGF23发挥作用的机制。结果显示,过表达FGF23使成骨细胞矿化结节的数量显著降低(P<0.001),OPN mRNA的表达显著上调(P<0.001),TNAP mRNA的表达显著下调(P<0.001),FGF23显著抑制了碱性磷酸酶(ALP)活性(P<0.001),同时使P-ERK以及P-ERK/ERK的蛋白表达水平显著上调(P<0.001)。FGFR3抑制剂处理部分反转了FGF23的抑制作用,具体表现为使FGF23 mRNA,OPN mRNA表达降低(P<0.001),使ALP活性恢复至对照组水平(P<0.001),同时抑制了ERK的磷酸化(P<0.001),但对TNAP mRNA的表达没有回调作用。以上结果说明,FGF23通过结合FGFR3显著抑制成骨细胞的矿化,ERK信号通路参与了FGF23的调控。综上研究,FGF23是成骨细胞矿化的抑制因子。钙、磷、维生素D和甲状旁腺激素均在体外调控鸡成骨细胞FGF23表达。FGF23作用于成骨细胞生长的不同阶段,通过FGFR3降低ALP酶活,抑制BMSCs的分化潜能,抑制磷酸盐生成和吸收,使矿化结节生成减少,从而抑制成骨细胞矿化,ERK信号通路参与了FGF23对成骨细胞矿化的调控。