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目的:构建基于pIERS-Gluc-2C9载体的哺乳动物细胞表达系统和基于pFastbac-dual-OR-2C9载体的昆虫细胞表达系统，对中国人群25种细胞色素P450酶2C9(CYP2C9)变异体的体外药物代谢功能进行系统研究。旨在研究中国人群CYP2C9遗传多态性对临床常用药物代谢活性的影响，为实现临床个体化用药提供有价值的理论依据。
方法:以野生型CYP2C9*1基因的全长cDNA为模板，通过定点诱变方法获得突变型CYP2C9变异体（CYP2C9*N）的cDNA全长。将之前发现的10种突变型CYP2C9*N与分泌型荧光素酶Gluc内参基因连接入pIRES载体的A、B多克隆位点，构建成真核生物双表达载体pIRES-Gluc-CYP2C9。利用Lipofectamine2000瞬时转染COS-7细胞，48小时后分别加入含100μM Luciferin-H荧光底物或双氯芬酸药物的新鲜培养基，利用Promega CYP2C9活性试剂盒及NEB Gluc检测试剂盒分别检测CYP2C9各型及内参Gluc的活性，用CYP2C9和Gluc信号值比值反映CYP2C9各型对荧光素底物的代谢活性;利用高效液相色谱仪定量分析双氯芬酸及其代谢产物羟基双氯芬酸，用代谢比（羟基双氯芬酸和双氯芬酸的比值）反映各型对双氯芬酸底物药的代谢活性。
将25种CYP2C9突变型cDNA与细胞色素P450氧化还原酶(CYPOR)cDNA连接入pFastbac-dual载体，构建成pFastbac-dual-OR-2C9昆虫细胞双表达载体，包装昆虫杆状病毒后侵染Sf21细胞，差速离心法获得表达各型突变体的昆虫微粒体。取2-20pmol微粒体以磺酰脲类降糖药（甲苯磺丁脲和格列美脲）为底物分别检测重组酶的体外代谢活性，并比较CYP2C9野生型与突变体蛋白之间的酶动力学参数(Km，Vmax及Vmax/Km)，以研究CYP2C9各变异体的体外代谢活性。
结果:本研究成功构建了10种pIRES-Gluc-CYP2C9哺乳动物细胞双表达载体，转染COS-7细胞后用于检测CYP2C9各型对特异性荧光素底物及双氯芬酸的代谢活性。结果显示，与野生型CYP2C9*1相比，CYPC29*49、*54活性明显升高，*51、*53、*47和*48的活性明显降低，但却高于典型突变体CYP2C9*2，其余突变体的活性相对最低，低于典型突变体CYP2C9*2。
本研究还成功构建了25种pFastbac-dual-OR-2C9昆虫细胞双表达载体，并获得了相应的昆虫细胞微粒体。以清除率(Intrinsic Clearance)作为评价药物代谢酶活性的标准，以甲苯磺丁脲为代谢底物，发现CYP2C9*51和*11活性比野生型CYP2C9*1高，*46、*53、*54、*29和*27活性介于CYP2C9*2和CYP2C9*1之间，*47、*34、*31、*48、*49、*50、*8、*14、*23和*45活性介于CYP2C9*3和CYP2C9*2之间，*16和*52活性介于CYP2C9*13和CYP2C9*3之间，*33和*19活性低于CYP2C9*13;以格列美脲为代谢底物，CYP2C9*47活性比野生型CYP2C9*1高，*54、*51和*54活性介于CYP2C9*2和CYP2C9*1之间，*48、*11、*49、*29、*50和*46活性介于CYP2C9*3和CYP2C9*2之间，*27、*31、*34、*8、*33、*45、*23、*14、*16和*52活性介于CYP2C9*13和CYP2C9*3之间，*19活性低于CYP2C9*13。
结论:本研究成功建立了两种CYP2C9体外表达及活性分析的方法，其中基于pIERS-Gluc-2C9载体的COS-7细胞表达系统操作简便，实验周期短，适于新突变体CYP2C9的快速活性检测;基于pFastbac-dual-OR-2C9载体的昆虫细胞表达系统操作较为复杂，实验周期长，但目的蛋白表达量高，适用于详细研究突变体的体外药物代谢特性及药物间相互作用。由于表达细胞内环境的不同，相对于野生型蛋白，虽然同一突变体在两套系统中的相对代谢活性存在差异，但总体趋势基本一致，特别对于代谢能力极显著下降的突变类型更为明显。我们的研究结果显示，绝大多数被测CYP2C9突变体均可引起蛋白的体外药物代谢特性发生明显改变，其中多数可引起活性明显下降，提示携带该突变类型的个体在临床应用经CYP2C9代谢药物时需密切观察，调整药物使用剂量。