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目的自身免疫性肝炎(Autoimmune hepatitis,AIH)是一种病因不明的肝脏慢性炎症性疾病。目前,AIH的治疗主要是应用免疫抑制剂如糖皮质激素,它可单独应用也可与硫唑嘌呤联合应用,但这种治疗方案的完全缓解率并不高,且长期服药存在较多副作用,因此迫切需要寻找和探讨新的有效治疗方法.骨髓间充质干细胞(Bone-marrow-derived mesenchymal stem cells,BMMSCs)是来源于骨髓中的一种多能干细胞,具有多方向分化的潜能及强大的免疫调节作用,大量动物实验和临床研究证实BMMSCs对多种自身免疫性疾病都有很好的治疗作用。本实验以刀豆蛋白A(Concanavalin A,ConA)诱导小鼠建立AIH模型,通过尾静脉途径移植氯甲基苯甲酰胺(Chloromethyl-benzamidodialkylcarbocyanine,CM-Di1)标记的BMMSCs,观察其在AIH中的治疗效果,以及移植后细胞在肝组织内存活、分布情况,并对其可能的治疗机制进行探讨,为临床BMMSCs的应用提供实验基础。材料和方法1.小鼠BMMSCs的分离、培养、鉴定及体外标记采用全骨髓贴壁法体外分离C57BL/6、鼠的BMMSCs,并进行传代培养。采取第三代BMMSCs,应用流式细胞仪检测其细胞表型,并采用茜素红染色鉴定其骨向分化能力,以油红0染色鉴定其脂向分化能力。体外应用CM-Dil荧光染料标记第三代BMMSCs,荧光显微镜下观察细胞标记率。2.AIH模型小鼠的建立将C57BL/6小鼠随机分为4组,分别为实验A、B、和C组及正常对照组。A组、B组和C组分别由尾静脉注射ConA10mg/kg-1、15mg/kg-1和20mg/kg,而正常对照组由尾静脉注射等体积的磷酸盐缓冲液。于注射后8h取血清检测谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)水平；取肝脏制作病理切片,根据Knodell肝炎活动指数评分系统对肝组织的炎症程度作出评分；取实验组小鼠心、脾、肺等组织观察有无炎症反应。3. BMMSCs肝组织中的分布情况及对AIH的治疗效果由尾静脉注射移植CM-Dil标记的BMMSCs,依据不同细胞量,将C57BL/6小鼠AIH模型组分为4组,尾静脉输注ConA,30min后移植CM-Dil标记的BMMSCs。模型Ⅰ组、模型Ⅱ组、模型Ⅲ组和模型Ⅳ组移植的细胞量分别为1×105,5×105,1×106,1×107；而空白对照组尾静脉输注ConA,30min后注入等体积的磷酸盐缓冲液。24h后处死小鼠,取血清标本检测ALT、AST及肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)、干扰素γ (Interferon-γ, IFN-γ)及白细胞介素(Interleukin-4, IL-4)的水平；取肝组织行病理检查其炎症程度并作出Knodell评分；取模型组心、肝、脾、肺组织在荧光显微镜下观察切片组织荧光分布情况。结果1.小鼠BMMSCs原代培养在接种48h后可见贴壁细胞,培养到第三代细胞形态趋于统一,细胞排列呈束状、漩涡状或放射状。流式细胞仪检测BMMSCs的表面特异性抗原,结果显示CD29、CD90呈阳性表达,CD34呈阴性表达；经诱导后茜素红染色、油红0染色均呈阳性,符合BMMSCs的特征。体外应用CM-Dil荧光染料标记第三代BMMSCs,24h后荧光显微镜下观察可见CM-Dil标记在细胞膜上发红色荧光,且标记率达90%以上。2.给以不同剂量的ConA后,A组、B组和C组血清ALT、AST的水平及Knodell评分均明显高于对照组(P<0.05),且随着ConA注射剂量的增加,上述各项检测指标均有增高(P<0.05)。实验组小鼠除肝组织病理可见肝损害,呈炎症改变以外,心、肺、脾未见损伤。3.BMMSCs移植治疗后,模型Ⅳ组小鼠有4只死亡,其余各组小鼠未见死亡。24h后模型Ⅱ组、模型Ⅲ组小鼠血清ALT、AST的水平及Knodell评分均明显低于空白对照组(P<0.05)；模型Ⅰ组与空白对照组之间比较上述指标无显著性差异(P>0.05)。模型Ⅱ组、模型Ⅲ组小鼠血清TNF-α、IFN-γ及IL-4的水平明显低于空白对照组(P<0.05)；模型Ⅰ组与空白对照组之间比较上述指标无显著性差异(P>0.05)。荧光显微镜下在受损的肝组织内可观察到植入的BMMSCs,而在心、脾、肺等重要脏器并未观察到标记的BMMSCs。结论1.小鼠的BMMSCs可采用全骨髓贴壁法在体外分离、培养、传代、扩增。新型荧光染料CM-Dil体外标记BMMSCs,方法简单,标记率高,可用于BMMSCs的体内示踪。2.ConA诱导制作AIH小鼠模型简单易行,且组织损伤具有肝脏特异性,可以用于AIH的实验研究。3. BMMSCs对ConA诱导的AIH小鼠模型有良好的治疗作用。BMMSCs可以迁移到受损的肝组织,并通过减少TNF-α、IFN-γ及IL-4等炎症因子的分泌而避免肝细胞的炎症反应,减轻肝脏损伤。