论文部分内容阅读
骨形态形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)在机体发育过程中发挥多种作用,尤其在骨骼发育和骨形成过程中。目前已经发现有20多种BMPs,其中BMP2,4,6,7和9具有促进间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化的作用。目前BMP2,7已经应用于美国等国家的骨相关疾病治疗。但近年来研究发现BMP2,7临床使用效果比预期差,临床治疗过程中常导致异位成骨、溶骨增加和严重水肿等副作用。因此,寻找成骨作用更强的BMPs及促进BMPs成骨作用的信号通路,从而促进MSCs和成骨BMPs在组织工程和再生医学中的应用是目前相关领域基础研究的热点之一。目前已经发现Notch在骨发育及重建中发挥重要的作用。我们前期的研究表明Notch信号促进BMP2,9诱导MSCs的成骨分化。那么Notch信号对其他的成骨相关BMPs(4/6/7)诱导成骨分化的作用如何?Notch信号促进BMPs成骨作用是否相同?其发挥促进BMPs成骨作用的机制如何?本研究拟针对上述问题,探讨Notch信号对BMPs诱导成骨作用的广泛性,并对其可能的机制进行研究,继而为BMPs的临床应用提供实验依据。第一部分:目的:探讨Notch信号对成骨BMPs诱导MSCs成骨分化的广泛性。方法:应用显性负性突变型Notch1腺病毒(Ad-dn Notch1)或γ-分泌酶抑制剂DAPT下调Notch信号,用DLL1腺病毒(Ad-DLL1)激活Notch信号。用碱性磷酸酯酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及活性检测成骨早期指标ALP和茜素红S染色对晚期成骨指标钙盐进行检测,并通过RT-PCR检测成骨相关基因ALP、Runx2、Col1a1的变化。结果:dn Notch1明显抑制了BMPs(4/6/7)诱导的早期成骨分化指标ALP。DAPT抑制了BMPs(4/6/7)诱导的早期成骨分化指标ALP和晚期成骨指标钙盐沉积及成骨相关基因的表达,且DAPT抑制作用呈剂量依赖性。DLL1显著促进BMPs(4/6/7)诱导的早期成骨指标ALP和晚期成骨指标钙盐沉积及成骨相关基因的表达。DAPT对BMP2/4/6/7/9诱导的ALP都有抑制作用,但抑制率没有明显差异。结论:Notch信号促进BMPs(4/6/7)诱导的MSCs成骨分化作用,结合前期在BMP2/9中的结果,Notch信号促进所有已知成骨BMPs诱导的MSCs成骨分化。第二部分:目的:探讨Notch信号促进成骨BMPs诱导的MSCs成骨分化的分子机制。方法:利用DAPT抑制Notch信号和Ad-DLL1激活Notch信号。首先,用Western blot和免疫细胞化学染色(immunocytochemistry,ICC)检测DAPT和Ad-DLL1对BMPs的经典信号通路中的Smad1/5/8的蛋白磷酸化水平和细胞内定位的影响。其次,采用q-PCR检测Notch信号对BMPs信号通路中发挥重要作用的受体ALK2基因水平的影响。最后,流式细胞术分析细胞周期的变化。结果:Western blot结果表明,DLL1可以促进成骨BMPs诱导p-Smad1/5/8的蛋白表达而对总的Smad1/5/8的蛋白表达没有明显的影响。DAPT抑制BMPs诱导p-Smad1/5/8的蛋白表达而对总的Smad1/5/8的蛋白表达没有明显的影响。ICC实验结果表明,DLL1促进BMPs诱导的p-Smad1/5/8在细胞核内表达,而DAPT抑制BMPs诱导的p-Samd1/5/8在细胞核内表达。q-PCR的结果表明,DLL1促进BMPs诱导的ALK2的基因表达,而DAPT抑制BMPs诱导的ALK2的基因表达。流式细胞术(flow cytometry,FCM)分析结果显示,单独的DLL1和BMPs对细胞的周期没有明显的影响,而DLL1和BMPs共处理后细胞的增殖周期G2+S期的比例明显增加。DAPT和BMPs共处理后细胞的增殖周期G2+S期的比例明显降低。结论:Notch信号通过影响BMPs/Smads信号通路及细胞的早期增殖促进MSCs成骨分化,而这一过程与Notch调控BMPs受体ALK2密切相关。第三部分:目的:Notch调控ALK2促进BMPs诱导的MSCs成骨分化的具体机制。方法:用DAPT抑制Notch信号,Ad-ALK2和Ad-Hey1上调ALK2和Hey1,Ad-dn ALK2下调ALK2的表达。ALP染色和活性分析检测成骨分化指标ALP。q-PCR检测基因ALK2和Hey1的表达。结果:ALP染色和活性分析结果表明,dn ALK2可以抑制BMPs(2/4/6/7/9)诱导的成骨分化。ALK2可以逆转DAPT对BMPs诱导成骨分化的抑制作用。Hey1也可以逆转DAPT对BMPs诱导成骨分化的抑制作用。q-PCR结果表明,Notch可以促进BMPs介导的基因Hey1的表达。Hey1也可以逆转DAPT对BMPs介导的基因ALK2的抑制作用。生物信息学分析结果表明,ALK2基因的启动子上有Hey1,Samd4,CSL的结合位点。结论:Notch,Hey1和BMPs信号相互作用共同调控ALK2表达促进MSCs的成骨分化。