Mitsugmin53(MG53),是一种肌特异性的RBCC/TRIM家族成员,又称为TRIM72蛋白。RBCC/TRIM家族蛋白的氨基端有三个高度保守的序列组成,分别是环指结构,锌指结构(B-box)和螺旋结构,在它的羧基端包含着PRY、SPRY等结构域,与人类的很多疾病的形成有关,可能参与到癌症形成,病毒感染等病理过程中。MG53蛋白特异性的在骨骼肌和心肌细胞中表达,主要以小囊泡的形式存在。大量研究表明MG53与细胞膜的损伤修复密切相关,一旦细胞膜发生损伤,MG53就会联合caveolin-3(小窝蛋白3),通过感知细胞内的氧化环境的变化,促进带有MG53的小囊泡向受损的部位募集并从细胞膜出芽,从而以膜片的方式进行修复。有研究报道,在心肌缺血再灌注损伤过程中,MG53能通过介导损伤细胞膜修复作用来对心肌起一个保护作用,同时在心肌缺血预适应这样一个保护心肌过程中,MG53也是一个重要的参与组成部分。心肌细胞膜瞬间外向钾通道(transient outward channel,Ito)是一种电压依赖性的钾通道,膜电位去极化时激活,具有快速激活和快速失活的特性,是构成动作电位(actionpotential,AP)复极化1期的主要钾电流,同时也是啮齿类动物复极化的主要钾电流,其改变对AP时程有重要影响,是疾病条件下引起心律失常的重要因为。本研究通过模拟临床上的缺血再灌注,建立缺氧复氧损伤的细胞水平模型,来探讨MG53对Ito电流及其对心电稳定性的影响,探索在心肌缺血再灌注过程中,MG53是否能通过介导对损伤心肌细胞膜上的离子通道重构的修复,而起到心脏保护作用。为临床上缺血再灌注等疾病的治疗提供一个新的靶点。　　 第一章正常条件下过表达MG53对大鼠心肌细胞膜上瞬间外向钾通道(Ito)功能的调节　　 本实验利用腺病毒载体技术,将带有MG53基因的重组腺病毒载体转染进乳鼠心肌细胞,使乳鼠心肌细胞过表达MG53,从而观察MG53对Lto功能的调控,并探讨正常生理条件下MG53对心肌细胞上Ito的功能和电生理机制的调节作用。结果表明:　　 1.MG53对瞬间外向钾通道(Ito)功能的调节　　 1.1.MG53对瞬间外向钾通道(Ito)电流密度和门控动力学的影响　　 乳鼠心肌细胞转染两种腺病毒,分别为AdMG53和AdGFP(作为对照),48h后膜片钳记录Ito电流。结果表明,较AdGFP组相比,AdMG53组Ito电流密度显著增加,增加了1.9倍(P=0.000<0.05)。即MG53能显著增加Ito电流密度,但对Ito通道的激活动力学无显著影响。AdMG53组在+60mV所产生电流达到峰值的时间(time to peak,TTP)较AdGFP组延长,但差异无统计学意义(P=0.168>0.05)。同时,MG53能显著减慢Ito通道的失活动力学,使Ito通道电流衰减的时间延长。AdMG53组电流峰值衰减一半的时间T0.5较AdGFP组显著延长(P=0.015<0.05),有统计学意义。　　 1.2.MG53对瞬间外向钾通道(Ito)电压依赖性激活的影响　　 AdMG53组电流密度在+10～+90 mV的电压范围内均显著高于AdGFP组P<0.05。AdGFP组与AdMG53组电压依赖性激活曲线无明显变化,V0.5,act分别为52.85±3.03 mV(n=14)和45.00±3.80 mV(n=10),P=0.116>0.05,k值两组之间无统计学意义,说明MG53不改变Ito的离子选择性,MG53对钾电流激活曲线无明显影响。　　 1.3.MG53对瞬间外向钾通道(Ito)电压依赖性失活的影响　　 与AdGFP组比,AdMG53组的电压依赖性失活曲线发生正向移位,AdGFP组和AdMG53组的V0.5,inact值分别为-23.65±3.35mV(n=9)和-15.13±2.17mV(n=11),t=2.208,P=0.040<0.05,有统计学意义。k值两组之间差异也无统计学意义。　　 2.MG53对瞬间外向钾通道(Ito)蛋白表达的影响　　 Ito由α亚基(主要为Kv4.2)和β亚基(主要为KChIP2)构成。本研究同时观察了过表达MG53对乳鼠心肌细胞以下2组蛋白表达量的影响:KChIP2和Kv4.2。结果表明,MG53能使乳鼠心肌细胞上的Ito的β亚基KChIP2蛋白的表达量显著增加,增加了3-4倍,有统计学意义(P=0.015<0.05)。但对Ito的α亚基Kv4.2蛋白的表达量无显著影响,差异无统计学意义(P=0.434>0.05)。结果表明,MG53上调Ito的一个重要机制是增加其β亚基KChIP2的表达量。　　 结论:　　 1.MG53能够增加瞬间外向钾通道(Ito)电流密度,减慢通道的失活动力学,但对Ito的激活动力学,以及电压依赖性激活无显著影响。MG53同时能够使Ito的电压依赖性失活曲线发生显著正向移位,但不改变Ito的离子选择性。　　 2.MG53显著增加KChIP2的表达量,但对Kv4.2蛋白的表达量无显著影响,提示MG53上调Ito的一个重要机制是增加Ito的β亚基的表达。　　 第二章缺氧复氧(H/R)损伤对新生大鼠心肌细胞膜上瞬间外向钾通道(Ito)功能的影响　　 大量研究报道发现缺血,缺氧可以使心肌细胞膜上的瞬间外向钾通道(Ito)受到抑制,本实验通过模拟临床的缺血再灌注损伤,在乳鼠心肌细胞上建立有效的缺氧复氧模型,根据相关文献报道以及预实验结果,建立缺氧4h复氧4h的缺氧复氧(H/R)模型,通过记录Ito电流,来检测模型是否成功,并进一步从分子水平来探索Ito各亚基的表达水平变化。　　 1.缺氧复氧(H/R)对瞬间外向钾通道(Ito)功能的调节　　 1.1.缺氧复氧(H/R)对瞬间外向钾通道(Ito)电流密度和门控动力学的影响　　 乳鼠心肌细胞于37℃,5％CO2培养24h后将培养基更换为缺氧液,放置低氧培养箱(37℃,1％O2,25％CO2)培养4h,再更换为复氧液,放置于37℃,5％CO2培养4h后膜片钳记录Ito电流。结果显示,缺氧复氧(H4/R4)组Ito电流密度低于正常(Normal)组,但差异无显著性。H4/R4组的 TTP较正常组比时间延长约3.11 ms,但差异无统计学意义(P=0.185>0.05)。同时,H4/R4组T0.5较正常组比时间延长约19.28 ms,但差异无显著性(P=0.256>0.05)。而两组细胞大小的差异有显著性,H4/R4能使乳鼠心肌细胞电容(capacitance)显著增加(P=0.000)。　　 1.2.缺氧复氧(H/R)对瞬间外向钾通道(Ito)电压依赖性激活的影响　　 H4/R4组电流密度在+20～+90 mV的电压范围内均显著低于Normal组,P<0.05。为观察H/R对Ito通道电压依赖性激活动力学特征的影响,将Ⅰ-Ⅴ曲线的结果转换成膜电导,对条件刺激电压作图,然后采用Boltzmarm方程g/gmax=1/{1+exp(V0.5-V)/k}进行拟合,式中得到Ito激活曲线,然后求得V0.5,act(半数激活电压)和k(斜率因子)。H4/R4组与Normal组的V0.5,act无显著差异(P=0.938>0.05),同时k值两组之间也无统计学意义,说明H/R不改变的Ito通道的离子选择,H/R对Ito电压激活曲线无明显影响。　　 1.3.缺氧复氧(H/R)对瞬间外向钾通道(Ito)电压依赖性失活的影响　　 H/R使Ito通道的电压依赖失活曲线略负向移位,但无统计学意义。H4/R4组和Normal组的半数失活电压V0.5,inact值分别为-29.15±3.28mV(n=7),-23.65±3.35mV(n=9),t=1.152,P=0.269>0.05,无统计学差异。同时两组之间的K值也无统计学差异。　　 2.缺氧复氧(H/R)对乳鼠心肌细胞本身MG53蛋白表达的影响　　 将培养24h的心肌细胞缺氧4h再复氧4h损伤后,提取细胞蛋白,根据BCA法蛋白定量结果,行 Western Blot检测,H4/R4组较Normal组相比MG53蛋白表达量没有变化,无统计学差异,P=0.085>0.05。结果表明,缺氧复氧(H/R)对心肌细胞本身的MG53的蛋白表达并没有影响。　　 3.缺氧复氧(H/R)对瞬间外向钾通道(Ito)的主要α亚基和β亚基的基因水平表达　　 Ito由α亚基(主要为Kv4.2)和β亚基(主要为KChIP2)构成。结果表明H4/R4能减少Kv4.2和KChIP2的mRNA水平表达量,H4/R4组较Normal组Kv4.2和KChIP2的mRNA水平表达量均发生显著减少,分别减少了81％,(P=0.000<0.05)和90％(P=0.002<0.05)。　　 结论:缺氧4h后再复氧4h心肌细胞本身表达的MG53未发生改变,而抑制了瞬间外向钾电流(Ito)。H/R能使的Ito电流密度减少。同时TTP和T0.5均延长,即减慢了Ito的激活和失活动力学,但差异无统计学意义。此外,H/R对Ito通道电压依赖性激活和失活曲线无显著改变,但能使Ito的主要α亚基Kv4.2和主要p亚基KChIP2的mRNA水平表达下降。　　 第三章缺氧复氧损伤下MG53对大鼠心肌细胞膜上瞬间外向钾通道(Ito)重构的调节作用　　 根据之前的结论,缺氧复氧(H/R)对心肌细胞本身的MG53表达没有影响,且缺氧复氧(H/R)改变了瞬间外向钾通道(Ito)的电生理特性和其亚基的mRNA水平表达量,缺氧复氧过程中,Ito发生重构。在正常情况下过表达MG53又能上调Ito,由此本实验通过在乳鼠心肌细胞中过表达MG53,在缺氧复氧损伤条件下探索MG53在离子通道重构中发生的作用。　　 1.MG53对缺氧复氧条件下损伤心肌细胞的瞬间外向钾通道(Ito)的主要α亚基和β亚基基因水平的影响　　 Kv4.2和KChIP2分别是Ito通道的主要α亚基和β亚基,乳鼠心肌细胞转染腺病毒48h后进行缺氧复氧(H/R)处理,提取样本进行Realtime-PCR检测Kv4.2和KChIP2的基因水平表达进行相对定量(即RQ值)。结果显示H4/R4M组与H4/R4G组比较,Kv4.2基因的表达水平未发生改变,无统计学差异,P=0.577>0.05。而H4/R4M组的KChIP2基因水平的表达量高于H4/R4G组,但差异无统计学意义(P=0.349>0.05)。　　 2.MG53对缺氧复氧条件下损伤心肌细胞的瞬间外向钾通道(Ito)的主要α亚基和β亚基蛋白水平的影响　　 MG53对H/R处理过的乳鼠心肌细胞的Ito的α亚基即Kv4.2的蛋白表达量没有影响(P=0.691>0.05)。但能使β亚基KChIP2蛋白表达量组显著增加,增加了3-4倍,有统计学意义(P=0.005<0.05)。　　 3.MG53对缺氧复氧条件下损伤的心肌细胞的瞬间外向钾通道(Ito)功能的调控　　 3.1.MG53对缺氧复氧条件下损伤的心肌细胞的瞬间外向钾通道(Ito)电流密度和门控动力学的影响　　 在缺氧复氧(H/R)损伤条件下,MG53能Ito电流密度增加,有统计学意义(P=0.001<0.05)。同时在H/R损伤下MG53对Ito通道的激活动力学和失活动力学无显著影响。H4/R4M组在+60mV所产生电流达到峰值时间(time to peak,TTP)较H4/R4G组比无显著差异,P=0.246>0.05。H4/R4M组电流峰值衰减一半的时间T0.5较H4/R4G组比没有显著差异,P=0.942>0.05,无统计学意义。两组细胞电容大小的无显著性差异,P=0.089>0.05。　　 3.2.MG53对缺氧复氧条件下损伤的心肌细胞的瞬间外向钾通道(Ito)电压依赖性激活的影响　　 细胞钳制在-80mV,给予250ms,从-40 mV开始以10mV递增到+90mV的电压刺激以激活Ito。H4/R4M组电流密度在0mV～+90 mV的电压范围内均显著高于H4/R4G组P<0.05。在此基础上,根据Ⅰ—Ⅴ曲线计算出标准化激活稳态(gm)的曲线,运用Boltzmann公式:G/Gmax=1/{1+exp[-(V-V0.5)/k]}拟合得到激活曲线,其中G/Gmax:通道电导百分数,V:膜电位,V0.5,act半数最大激活电压,k:斜率因子。结果表明H4/R4G组和H4/R4M组之间V0.5,act无显著性差异(P=0.877>0.05),K值两组之间也无显著差异,说明缺氧复氧(H/R)损伤条件下MG53不改变的Ito通道的离子选择,且对Ito电压依赖性激活曲线无显著影响。　　 3.3.MG53对缺氧复氧条件下损伤的心肌细胞的瞬间外向钾通道(Ito)电压依赖性失活的影响　　 结果表明,H4/R4M组较H4/R4G组比,Ito电压依赖性失活曲线发生正向移位,V0.5,inact值分别为-19.70±2.14mV(n=14),-29.15±3.28mV(n=7),t=2.488,P=0.022<0.05,有统计学差异。两组的K值无统计学差异。　　 结论:在缺氧复氧损伤条件下,过表达MG53能使缺氧复氧过程中被抑制的Ito上调。在Ito的主要α亚基和β亚基的蛋白表达水平上,过表达MG53使KChIP2蛋白表达增加,而对Kv4.2的蛋白表达无显著影响。