睾丸支持细胞对动物睾丸的发育和精子发生有着至关重要的作用,未成熟支持细胞的数量、结构、功能决定了动物个体的生精效率和繁殖能力。本课题组前期转录组数据分析发现:miR-432在中国荷斯坦初生公牛和成年公牛的睾丸组织中差异表达,因此推测miR-432可能参与中国荷斯坦公牛的睾丸发育以及精子发生的调控过程,但具体作用及其机制尚不清楚。本研究首先分离了新生牛未成熟睾丸支持细胞,通过对所分离的细胞进行福尔根染色和睾丸未成熟支持细胞标志性基因的q RT-PCR检测,以及标志性基因的免疫荧光染色,鉴定所分离细胞的类型与纯度。结果表明:所分离细胞生长状态良好,符合未成熟支持细胞形态;福尔根染色后有明显的双极小体出现;能够表达支持细胞标志性基因SCF、GDNF、BMP4、GATA4和FASL,同时未成熟支持细胞标志性基因KRT-18也呈高表达。其次,构建了miR-432的干扰和过表达载体,并采用CCK-8法筛选了miR-432的最佳转染时间,采用q RT-PCR、Western blot以及EDU法鉴定了miR-432对未成熟支持细胞增殖和分泌功能的影响,并通过q RT-PCR、Western blot以及流式细胞术,检测了miR-432对未成熟支持细胞凋亡的影响。结果表明:当miR-432过表达时,未成熟支持细胞（Sertoli cells,SCs）中PCNA m RNA和蛋白表达量均显著升高（P<0.05）,支持细胞的增殖增加,caspase-3的m RNA和蛋白表达量均显著降低（P<0.05）,支持细胞的凋亡率显著降低,其特异性分泌因子FGF2、GDNF、BMP4、CXCL12的m RNA表达量均极显著升高（P<0.001）,ABP的蛋白表达水平显著升高（P<0.05）;而当miR-432被抑制时,SCs中上述指标均呈相反趋势,SCs增殖减少,凋亡增加。在此基础上,基于在线网站Targetscan和本课题组转录组数据中靶标关系的预测,预测并筛选了miR-432的潜在靶基因REM1（RRAD和GEM样GTPase1,REM1）。构建了包含miR-432和REM1基因3’UTR区潜在结合位点的野生型（Wild Type）和突变型（Mutant）的双荧光素酶报告载体。双荧光素酶报告实验、q RT-PCR和Western blot结果显示,当miR-432过表达时,REM1基因的m RNA和蛋白表达水平显著降低（P<0.05）;当miR-432被抑制时,REM1基因的m RNA和蛋白表达量均显著升高（P<0.05）;miR-432 mimics、miR-sh NC分别与野生型/突变型荧光素酶报告载体共转染时,miR-432+野生型组的荧光素酶的活性比值显著低于其余各组（P<0.05）,说明REM1是miR-432的直接靶标。最后构建了REM1基因的干扰载体,通过q RT-PCR、western blot、EDU和流式细胞术验证了REM1基因对SCs增殖、凋亡和分泌功能的影响。结果表明:当REM1基因被抑制时,SCs中PCNA m RNA和蛋白表达量均显著升高（P<0.05）,支持细胞的增殖增加,caspase-3的m RNA和蛋白表达量均显著降低（P<0.05）,支持细胞的凋亡率显著降低,其特异性分泌因子FGF2、GDNF、BMP4、CXCL12的m RNA表达量均极显著升高（P<0.05）,ABP蛋白的表达水平显著升高（P<0.05）。本研究揭示了miR-432在未成熟支持细胞中的功能,发现miR-432能够促进牛睾丸未成熟支持细胞增殖及其分泌功能的发挥,抑制其凋亡。验证了miR-432与REM1基因的靶向调控关系,以及靶基因REM1对牛睾丸未成熟支持细胞增殖、凋亡以及分泌功能的影响,提示miR-432可能通过下调REM1基因的表达,从而促进增殖细胞核抗原以及支持细胞特异性分泌因子的表达,抑制caspase-3的表达,进而调控未成熟支持细胞的增殖和凋亡,间接参与睾丸发育和精子发生过程。