论文部分内容阅读
研究目的：利用重复经颅磁刺激对局灶性脑缺血再灌注成年大鼠进行干预,研究重复经颅磁刺激对脑缺血再灌注损伤大鼠运动功能及侧脑室室管膜下区NSCs增殖的影响,并探索可能的机制。材料与方法：将45只成年雄性SD大鼠进行随机分组,分成假手术组、模型组和rTMS组,每组15只。采用右侧大脑中动脉栓塞(middle artery occlusion,MCAO)模型,梗阻80分钟。rTMS组于造模成功后24h开始干预,每天一次,连续干预7天,期间假手术组和模型组不接受任何干预。每组大鼠在术后第1天和第7天给予神经功能评分(neurological severity scores,NSSs),部分大鼠(每组5只)在rTMS组最后一次治疗结束后即刻开始进行腹腔内注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxy Uridine, BrdU)以标记增殖的细胞,每隔4小时注射一次,连续注射3次。另一部分大鼠(每组10只)在术后第7天取患侧缺血脑组织。利用NSSs评分观察rTMS对MCAO大鼠运动功能的影响,利用免疫组化荧光双重标记技术检测患侧SVZ内源性NSCs增殖的情况,利用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测microRNA-25(miR-25)相对表达量,利用免疫组织蛋白印迹(Western blotting)检测miR-25增殖相关靶蛋白的变化。统计学数据分析采用单因素方差分析,组间两两比较采用Bonferroni检验。结果：1.模型组和rTMS组的大鼠术后1天时进行NSSs评分结果无显著差异(p>0.05)；术后7天时两组大鼠NSSs评分于第1天相比较均得到明显改善(p<0.005),且rTMS组大鼠的神经功能改善程度优于模型组大鼠(p=0.019)。2.利用BrdU+/Nestin+标记患侧SVZ增殖的NSCs数,结果发现术后7天,模型组较假手术组NSCs增殖数增多且存在显著的差异(p=0.044);rTMS组较模型组及假手术组NSCs增殖数目均有显著增多且存在统计学意义(p<0.005)。3. qRT-PCR的结果显示术后7天时,模型组大鼠患侧脑缺血组织内miR-25的表达明显高于假手术组(p<0.001); rTMS组患侧脑缺血组织miR-25表达较其他两组(p<0.001)均显著增高。4. Western blotting的结果发现术后7天时,miR-25靶蛋白p57和PTEN在假手术组以及模型组的表达无显著性差异(p>0.05)；而rTMS组大鼠患侧脑缺血组织内p57的表达较其他两组明显减少(p<0.01),PTEN的表达则较其他两组显著增加(p<0.01)。结论：10Hz rTMS干预患侧大脑皮层7天能促进局灶性脑缺血大鼠运动功能的恢复,并促进患侧SVZ内源性NSCs的增殖,且这种促NSCs增殖的作用可能与上调miR-25的表达进而降低其靶蛋白p57的表达有关。研究目的：通过侧脑室注射miR-25拮抗剂抑制miR-25的表达,探索参与调节NSCs增殖的miR-25/p57在rTMS促进局灶性脑缺血后患侧SVZ内源性NSCs增殖中的作用,进一步证实rTMS对内源性NSCs的增殖效应与miR-25/p57密切相关。材料与方法：将成年雄性SD大鼠进行随机分组,分成rTMS组、rTMS+拮抗剂组和rTMS+对照剂组,每组15只。造模方式为右侧大脑中动脉栓塞(middle artery occlusion,MCAO),梗阻80分钟。rTMS+拮抗剂组及rTMS+对照剂组分别予以不同剂量的miR-25拮抗剂和miR-25对照剂侧脑室注射后进行右侧MCAO造模。所有大鼠造模成功后24h开始给予rTMS干预,每天一次,连续干预7天。各组大鼠在术后7天取患侧的脑组织,通过qRT-PCR检测miR-106b-25家族的相对表达量,确定合适的拮抗剂剂量。在miR-25被特异性抑制后,部分大鼠(每组5只)在术后第7天取患侧的脑组织进行Western blotting检测相关靶蛋白的变化,另一部分大鼠(每组5只)在rTMS组最后一次治疗后即刻开始进行腹腔注射BrdU以标记增殖的细胞,每隔4小时一次,连续3次。利用免疫组化荧光双重标记技术检测miR-25抑制后患侧SVZ内源性NSCs的增殖情况。统计学数据分析采用单因素方差分析,组间两两比较采用Bonferroni检验。结果：1.miRNA拮抗剂可抑制相关miRNA表达,并表现出剂量依赖性。2. qRT-PCR结果显示2.5nmol Ant-25可以显著抑制miR-25的表达,且不影响miR-106b家族其他成员的表达。3.Western blotting结果显示miR-25被抑制后,拮抗剂组的p57表达较rTMS组(p=0.018)和对照剂组(p=0.012)显著提高,而p21的表达在各个组之间差异没有统计学意义(p>0.05)。4.利用BrdU+/Nestin+标记患侧SVZ增殖的NSCs数,结果显示miR-25被抑制后,rTMS组和对照剂组NSCs增殖数无显著差异(p>0.05)；拮抗剂组较rTMS组(p=0.006)及对照剂组(p=0.013)NSCs增殖数明显减少且有统计学意义。结论：MiR-25特异性有效性的抑制后,靶蛋白p57表达升高,而大鼠脑缺血侧SVZ内源性NSCs增殖降低,即10Hz rTMS可以通过干预miR-25来调节其靶蛋白p57的表达,进而促进NSCs的增殖。研究目的：利用rTMS对局灶性脑缺血大鼠进行干预,研究rTMS对脑缺血大鼠学习记忆功能的影响,并观察患侧海马区神经再生和凋亡的情况。材料与方法：将成年雄性SD大鼠进行随机分组,分成7天组和14天组,两组再进行随机分组,分成假手术组、模型组和rTMS三个亚组。采用右侧MCAO模型,梗阻80分钟。rTMS组于造模成功后24h开始干预,每天一次,直到相应治疗时间结束,期间假手术组和模型组不接受任何干预。各组大鼠在术后第1天、第7天和第14天利用磁共振(magnetic resonance imaging,MRI)进行弥散加权成像(Diffusion-weighted images,DWI)检查,并根据DWI获取表观弥散系数(apparent diffusion coefficient,ADC)值。7天组的大鼠(每组5只)在rTMS组最后一次治疗结束后即刻开始进行腹腔内注射BrdU以标记增殖的细胞,每隔4小时注射一次,连续注射3次。另一部分大鼠(每组10只)在术后第7天取患侧缺血脑组织。14天组的部分大鼠(每组5只)于术后第一天开始,每天腹腔注射一次BrdU来标记分化的细胞,连续注射一周。另一部分大鼠在术后第12天进行Morris水迷宫测试,并于第14天处死取患侧海马组织,分别进行Tunel染色(每组5只)和western blotting检测(每组5只)。利用缺血侧ADC值与健侧ADC比值研究rTMS对MCAO大鼠脑梗体积的影响,采用Morris水迷宫实验观察rTMS对MCAO大鼠的学习记忆的影响,利用免疫组化荧光双重标记技术检测患侧SGZ内源性NSCs增殖和分化的情况,利用Tunel染色观察患侧海马神经元凋亡的情况,利用western blotting证实患侧海马凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤／白血病基因2(B cell lymphoma/leukemia gene 2,Bcl-2)和Bcl基因相关蛋白(Bcl2-associated protein X,Bax)的表达变化。统计学数据分析采用单因素方差分析,组间两两比较采用Bonferroni检验。结果：1.模型组和rTMS组的大鼠术后1天时梗死灶体积差异无统计学意义(p=0.878),但两组大鼠都可见明显梗死灶且有统计学意义(p<0.001)。第7天(p=0.246)和14天(p=0.132)时模型组和rTMS组之间梗死灶体积无统计学差异,但rTMS组大鼠脑梗死灶体积的改善较模型组的大鼠趋于更优。此外,虽然模型组和rTMS组大鼠在术后7天及14天时,梗死灶体积均较第1天明显减小(p<0.001),但模型组(p=0.716)和rTMS组(p=0.264)第14天较第7天差异均没有统计学意义。2. Morris水迷宫结果显示,模型组大鼠与假手术组相比逃避潜伏期明显延长(p=0.042),60s内穿越目标区域的次数也明显减少(p=0.001); rTMS组较模型组大鼠逃避潜伏期显著缩短(p=0.006),60s内穿越目标区域的次数也显著增多(p=0.045)。3.利用BrdU+/Nestin+标记患侧SGZ区增殖的NSCs数,结果显示术后7天,模型组较假手术组增殖的NSCs数增多且有统计学意义(p=0.042);rTMS组较假手术组及模型组增殖的NSCs数均明显增多且有显著差异(p<0.001)。4.利用BrdU+/NeuN+标记患侧SGZ区分化的NSCs数,结果显示术后14天,rTMS组较假手术组(p=0.006)及模型组(p=0.021)NSCs分化数目均显著增多且有统计学意义。而模型组较假手术组NSCs分化数未见统计学差异(p>0.05)。5. Tunel染色结果显示术后14天,模型组大鼠患侧海马神经元凋亡数目较假手术组显著增多且有统计学意义(p<0.001),而rTMS组大鼠患侧海马神经元凋亡数目较模型组明显减少且有统计学差异(p<0.001)。6. Western blotting结果显示,与假手术组相比,模型组患侧海马Bcl-2表达下降(p<0.01), Bax表达升高(p<0.01)。而rTMS组的Bcl-2表达较模型组明显升高(p<0.005), Bax的表达则较模型组显著降低(p<0.005)。结论：局灶性脑缺血大鼠学习记忆能力下降,但lOHz rTMS能改善局灶性脑缺血大鼠学习记忆的恢复,并能有效促进局灶性脑缺血大鼠患侧SGZ内源性NSCs增殖和分化和通过调节凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax抑制局灶性脑缺血大鼠患侧海马神经元的凋亡。