背景和目的牙周病治疗的最终目标是在控制牙周炎症的基础上完成牙周组织的重建。牙周再生一直是牙周领域的研究热点,目前应用于牙周再生的方法主要有：引导组织再生术(guided tissue regeneration, GTR)、骨材料移植、生长因子的应用以及近年来研究较多的组织工程技术。然而这些手段都不能实现牙周组织的完全再生,仅能不同程度地重建部分牙周附着,其中牙骨质的再生显得尤为困难,目前仍不能预测牙骨质再生的数量和质量。牙骨质是围绕在牙根周围的一薄层矿化结缔组织,是牙周组织的重要组成部分。牙骨质的最主要生理功能是为牙周膜纤维提供附着的锚点。牙骨质中羟基磷灰石占50%,牙骨质基质占50%。由胶原蛋白和非胶原蛋白构成。近些年的研究发现牙骨质基质中含有多种非胶原蛋白和生长因子,如骨涎蛋白(bone sialoprotein, BSP)、骨桥素(osteopontin, OPN)、纤连蛋白(fibronectin, FN)、骨形态蛋白(bone morphogenetic protein, BMP-2,-3,-4)、血小板来源生长因子-α,β (platelet-derived growth factor-a and β, PDGF-a and β)、转化生长因子(transforming growth factor, TGF-β)等,其独特的细胞外基质成分可能为牙骨质的再生提供一个良好的微环境。本课题组的前期实验也发现经EDTA处理的人健康的牙骨质根片能够诱导人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells, hPDLCs)向成牙骨质细胞方向转化,从而促进牙骨质新生。然而,这一结论是否同样适用于牙周炎累及的病变牙骨质呢?如果不能,是否有一些生长因子能够增强其促进牙骨质再生的作用呢?当牙周炎症破坏牙龈胶原纤维到达牙根表面时,牙骨质的结构和成分就遭到了破坏,称为病变牙骨质。虽然有研究发现病变牙骨质在去除牙石菌斑基础上经过简单抛光也能达到牙周健康,但近几年一些学者的研究发现病变牙骨质基质内的一些非胶原蛋白成分发生了改变,如骨涎蛋白(BSP)、骨桥蛋白(OPN)、纤粘连蛋白(FN)等。这些成分的改变势必影响了牙骨质的细胞外基质环境,这种病变牙骨质是否仍有利于牙骨质再生,目前鲜有报道。在众多应用于牙周再生的生长因子中,釉基质蛋白(enamel matrix proteins, EMPs)被公认具有促进牙骨质再生的作用。EMPs是一组以釉原蛋白为优势的蛋白,它并不是单一的生长因子,它的存在可能一定程度上模仿了牙骨质发育时期的情况。釉基质衍生物(enamel matrix derivative, EMD)是经过纯化的釉基质蛋白,其主要成分为釉原蛋白(amelogenin),商品名为Emdogain,广泛应用于临床和动物实验。动物实验发现EMD能够诱导形成无细胞外源纤维性牙骨质。临床对比试验发现应用EMD比应用屏障膜能够获得更多的临床附着。近几年的研究发现EMD在体外能够对多种细胞的生物学性能产生影响,并能诱导多种细胞,如牙周膜细胞、骨髓基质细胞等向成骨／成牙骨质细胞方向分化。但目前EMD在牙骨质表面和牙本质表面上的作用是否不同尚未见报道。因此,本研究的目的在于观察原位保留的牙周炎病变牙骨质是否能够促进牙骨质再生,在保留牙骨质的基础上加入EMD是否能强化牙骨质再生的效果。方法1.原位保留病变牙骨质联合应用EMD对人牙周膜细胞成牙骨质分化的研究1.1病变牙骨质原位保留对人牙周膜细胞成牙骨质分化影响的体外研究收集因牙周炎Ⅲ度松动而拔除的前牙和前磨牙48颗,并沿牙龈边缘和牙周袋底做标记。沿标记截取中间部分,EMS超声器械去除根面牙石菌斑后纵裂为对称的两片,一片用刮治器去除根面牙骨质,暴露根面牙本质(dentin, D组),另一片保留牙骨质(cementum, C组)。所有根片经24%EDTA凝胶酸蚀2min后于20万U／ml青霉素链霉素溶液4℃浸泡48h,无菌PBS冲洗后备用。收集因正畸需要拔除的前磨牙的牙周膜,组织块法原代培养人牙周膜细胞,胰酶消化,收集第二代细胞用于后续实验。C组和D组各取24片置于48孔板内,第二代牙周膜细胞以1×106／ml的浓度接种到根片表面,共培养7天后,每组取四片进行扫描电镜观察,每组剩余20片分别用微量RNA提取试剂盒提取总RNA,荧光实时定量PCR的方法检测两组牙骨质附着蛋白(cementum attachment protein,CAP)和牙骨质蛋白-23(cementum protein-23,CP-23)的mRNA表达量。1.2原位保留病变牙骨质联合应用EMD对人牙周膜细胞体内形成牙骨质的影响牙本质组和牙骨质组根片各取24片置于48孔板内,第二代牙周膜细胞以1x106个/ml的浓度接种到根片表面,按照重悬液的不同,将两组根片分为四组：牙骨质片滴加DMEM培养液为C组,牙骨质片滴加EMD培养液为E+C组,牙本质片滴加DMEM培养液为D组,牙本质片滴加EMD培养液为E+D组。每三天换液一次,共培养至第七天时,用聚四氟乙烯膜包裹根片,植入裸鼠背部皮下,每只裸鼠共植入四片,每组一片。三周后处死裸鼠取出根片,10%EDTA液脱钙后进行常规石蜡包埋、5μm切片、HE染色,观察四组标本新生组织的形成情况,对有牙骨质类似物形成的标本进行BSP的免疫组化染色观察。2.原位保留病变牙骨质联合应用EMD在Ⅲ度根分叉病变牙骨质再生及新附着形成中的作用选取雄性比格犬八只,双侧下颌第三第四前磨牙(P3P4)作为实验牙位。实验当日前四周,在实验牙位制作高度为5mm的Ⅲ度根分叉骨缺损并置入含有牙周混合菌的棉球2周,以建立Ⅲ度根分叉病变模型。实验当日前2周将棉球取出,并对实验牙位进行龈下刮治以去除菌斑牙石。此后每天用氯己定溶液进行口腔卫生护理。手术当天,未见明显炎症和牙龈退缩,每只比格犬的双侧P3P4按随机原则接受下列处理方法中的一种：C：保留病变牙骨质+EDTA酸蚀2min；D：刮除病变牙骨质+EDTA酸蚀2min；E+C：保留病变牙骨质+EDTA酸蚀2min+EMD凝胶；E+D：刮除病变牙骨质+EDTA酸蚀2min+EMD凝胶。各组均在全麻下颊侧翻瓣,刮除肉芽组织,并按实验要求处理相关根面,并于根分叉入口覆盖海奥胶原膜。基于本实验的目的和实验操作方便的考虑,操作过程中未给以舌侧翻瓣。术后八周4%多聚甲醛灌注法处死动物,取出标本,每组共获8个标本,每组取2个标本进行硬组织包埋处理,切片,甲苯胺蓝染色,进行组织学观察。每组剩余6个标本进行常规脱钙,石蜡包埋,5μm切片,HE染色,进行新生组织的观察和测量。结果1.根面保留病变牙骨质联合应用EMD对人牙周膜细胞成牙骨质分化的研究1.1病变牙骨质原位保留对人牙周膜细胞成牙骨质分化影响的体外研究牙周膜组织块贴壁7-10天左右,倒置显微镜下可见单个细胞从组织块周边游出,当细胞密度达瓶底80%时可进行传代。传代后的细胞经免疫染色显示波形丝蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性,证明培养的细胞是中胚层来源的间充质细胞且无外胚层来源的细胞污染。第二代牙周膜细胞接种于两组根片后的扫描电镜显示：两组根片上细胞生长良好,牙本质片上细胞呈长梭形,牙骨质片上细胞略大,长梭形态不明显。荧光实时定量PCR的结果显示：牙骨质组(C组)CAP mRNA表达量显著高于牙本质组(D组),差异有统计学意义(P=0.001)；C组CP-23mRNA表达量显著高于D组,差异有统计学意义(P=0.003)。1.2原位保留病变牙骨质联合应用EMD对人牙周膜细胞体内形成牙骨质的影响裸鼠植入根片后,活动良好,未出现饮食异常。术后一周拆线,除一只裸鼠的左上伤口缝线已开,根片脱离外,其余伤口均愈合良好。聚四氟乙烯膜包绕根片位于裸鼠皮下,无感染,无暴露。三周时取材,D、E+C、E+D三组均获得12个标本,C组获得11个标本。HE染色结果显示：D组与E+D组均无牙骨质类似物形成,新生物均为疏松的纤维结缔组织；C组有7个标本表现为新生牙骨质类似物形成,E+C组有10个标本表现为新生牙骨质类似物形成,两组间差异有统计学意义(P<0.01)。BSP染色结果发现所有的新生牙骨质类似物均对BSP染色阳性。3.原位保留病变牙骨质联合应用EMD在Ⅲ度根分叉病变牙骨质再生及新附着形成中的作用我们成功建立了32颗比格犬下颌前磨牙的Ⅲ度根分叉病变模型。术后八周,所有牙位愈合良好,无明显感染或牙龈退缩。组织学测量结果显示,新生牙骨质百分比：C组显著高于D组,而E+C组和E+D组显著高于C组,E+C组和E+D组组间差异不显著。新生骨百分比：C组显著高于D组,而E+C组和E+D组显著高于C组,E+C组和E+D组组间差异不显著。组织学观察发现,D组新生牙周膜纤维稀疏,无主纤维束,与新生牙骨质和牙槽骨平行排列或排列混乱,未插入其中形成良好的新附着；C组新生牙骨质沉积在原有牙骨质表面,牙周膜纤维排列整齐,且有主纤维束分别插入新生牙槽骨和牙骨质中,形成新附着；E+D组与E+C组新生牙骨质数量多,牙周膜纤维粗大,大多建立了良好的新附着,但E+D组多见新生牙骨质与牙本质表面存在裂隙,新生牙周膜纤维排列杂乱。硬组织切片观察结果与石蜡切片结果相似,但未见明显的新生牙骨质与根面分离的情况。结论1.经EDTA处理的病变牙骨质能诱导牙周膜细胞分化为成牙骨质细胞,从而促进新生牙骨质的生成,EMD的存在能够增强这一诱导作用。2.原位保留病变牙骨质有利于牙骨质的再生和新附着的建立,加入EMD能够强化这一效果。