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目的恶性肿瘤是危害人类生命健康的疾病之一,它的发病以及进展的机制研究已成为当前医学领域的重大研究方向。可变剪接是一种常规的生物学过程,是产生蛋白质组多样性的原因,它的紊乱可以引起包括肿瘤在内的多种疾病的发生。近年来的研究发现在肿瘤转录组中出现大量可变剪接方式的改变,这种改变能够导致肿瘤的发展、转移以及耐药。然而,这种可变剪接的改变及其在肿瘤中的重要性,仅仅处于研究的初步阶段。因此,全面了解可变剪接潜在的功能能够帮助我们发现新的致癌机制以及治疗靶点。研究发现Intersectin1(ITSN1)蛋白与肿瘤密切相关,据报道ITSN1蛋白表达受选择性剪接高度调控:在前体m RNA(pre-m RNA)形成成熟m RNA的过程中,能够产生两种亚型:短亚型(ITSN1-S)和长亚型(ITSN1-L)。本研究通过分析胶质瘤样本的转录组数据发现ITSN1通过选择性剪接产生的两种亚型在肿瘤组织和正常组织中的表达出现异常:ITSN1-L的m RNA在胶质瘤组织中低表达并且与胶质瘤恶性进展呈负相关;而ITSN1-S与其恰恰相反。本课题组前期已对ITSN1-S在胶质瘤中的功能进行了深入的研究,它可以作为促癌蛋白促进胶质瘤的恶性进展,但关于ITSN1-L在胶质瘤中的功能尚未有报道。基于此现状,本课题组开展了ITSN1-L在胶质瘤进展中的功能研究,比较两亚型之间的功能差别,并探索ITSN1-L抑制胶质瘤进展的具体分子机制。此项研究是一个全新的发现,不仅补充了ITSN1-L亚型在胶质瘤中的功能研究,还为从选择性剪接的方向调节恶性胶质瘤进展提供了实验支持,并为研究以及寻找治疗疾病的有效靶点提供了切入点,有望为恶性胶质瘤的治疗开拓新的思路和方向。方法一、临床样本中ITSN1亚型的表达、意义及生物信息学分析1.本研究选取癌症基因图谱库(The Cancer Genome Atlas,TCGA)中具有完整随访信息的5例正常脑组织和673例胶质瘤转录组数据,统计分析并比较ITSN1-L的表达、ITSN1-S的表达及两转录本的表达比值与组织学级别的关系;Kaplan-Meier(K-M)分析ITSN1-L及两亚型比值的表达与胶质瘤患者预后的关系。2.分析ITSN1-L高低表达样本间的差异基因(Differential expression genes,DEGs);随后,利用DAVID在线分析工具对DEGs进行基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析,并对其进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)功能富集分析;依据ITSN1-L的表达对胶质瘤样本进行基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)。二、ITSN1两亚型对胶质瘤细胞增殖的影响1.构建敲降ITSN1-S、过表达全长ITSN1-L及其关键结构域的胶质瘤细胞系,利用Brd U、ATP法、SRB法及三维克隆增殖实验检测细胞的增殖能力。2.运用Crisper/Cas9技术构建ITSN1基因敲除胶质瘤细胞系;构建过表达ITSN1-S、过表达ITSN1-L及其关键结构域的ITSN1敲除胶质瘤细胞系,通过细胞增殖实验检测细胞的增殖能力。3.利用裸鼠皮下移植瘤模型,测量各移植瘤的瘤体大小,并对移植瘤组织切片行Ki67免疫组化染色(S-P法)。三、ITSN1两亚型对胶质瘤细胞迁移侵袭的影响及ITSN1-L抑制胶质瘤细胞迁移侵袭的分子机制1.通过划痕实验、Transwell迁移及侵袭实验检测ITSN1两亚型对胶质瘤细胞迁移侵袭能力的影响;对裸鼠皮下移植瘤组织切片行HE(Hematoxylin-Eosin)染色;分析TCGA数据库中ITSN1-L高低表达胶质瘤样本间侵袭相关差异基因,并通过q RT-PCR验证细胞中相应基因的m RNA水平。2.利用免疫沉淀体外富集并银染、质谱检测ITSN1-L相互作用蛋白,并进行验证;Western blot及免疫荧光检测细胞中ac-tubulin的表达;Nocodazol处理细胞后,利用免疫荧光检测微管的稳定性。3.构建稳定降表达HDAC6和SIRT2的胶质瘤细胞系,通过Tubacin药物洗脱实验检测细胞中ac-tubulin的累积速率及去乙酰化的情况,并利用细胞功能学实验检测提高ac-tubulin的表达(降表达HDAC6或者Tubacin处理)后对胶质瘤细胞迁移侵袭能力的影响。四、ITSN1-L影响胶质瘤细胞粘附的关键结构域及分子机制1.利用Adhesion、Detachment和Aggregation实验检测ITSN1-L对胶质瘤细胞粘附的影响并寻找其关键结构域;利用免疫荧光、Western bolt、q RT-PCR检测细胞与胞外基质粘附分子和细胞间粘附分子及相应转录因子的变化情况。2.利用免疫共沉淀验证ITSN1-L与ANXA2的相互作用;构建稳定降表达ANXA2的胶质瘤细胞系,通过Western blot和q RT-PCR检测N-cadherin及相关转录因子的表达情况,同时利用粘附功能学实验检测胶质瘤细胞的粘附能力。3.利用免疫共沉淀验证ITSN1-L与TUBB的相互作用;Western blot及q RT-PCR检测肿瘤细胞中TUBBs的表达情况;构建稳定降表达TUBB3和TUBB4的胶质瘤细胞系,通过Western blot检测N-cadherin的表达情况,利用Aggregation实验检测细胞间的粘附情况,通过免疫荧光检测N-cadherin的定位变化。结果一、临床样本中ITSN1亚型的表达、意义及生物信息学分析1.相对于正常组织,ITSN1-L的m RNA在胶质瘤中低表达并随组织学级别的升高而降低,ITSN1-S的m RNA在胶质瘤中高表达,ITSN1-S与ITSN1-L的m RNA表达比值随组织学级别的升高而升高。2.K-M生存分析结果显示ITSN1-L低表达患者的总生存期(Overall survival,OS)明显缩短(P<0.001);ITSN1-S与ITSN1-L的m RNA表达比值高的患者OS明显缩短(P<0.001)。3.GO功能富集分析结果显示:ITSN1-L高低表达样本间的差异基因能够参与细胞连接、胶原代谢、细胞外基质的重构以及神经递质的释放等生物学过程;KEGG通路富集结果显示:差异基因大多集中在黏着斑、间隙连接、ECM受体相互作用等信号通路;GSEA结果显示:ITSN1-L可能参与细胞的粘附、迁移以及微管相关运动功能。二、ITSN1两亚型对胶质瘤细胞增殖的影响1.增殖实验结果显示:敲降ITSN1-S显著降低胶质瘤细胞的增殖,而过表达ITSN1-L或其关键结构域(DH-PH-C2)不影响胶质瘤细胞的增殖。2.成功构建过表达ITSN1-S、ITSN1-L及其关键结构域(DH-PH-C2)的ITSN1敲除细胞系,增殖实验显示:敲除ITSN1抑制胶质瘤细胞的增殖,过表达ITSN1-S能够促进敲除细胞增殖,而过表达ITSN1-L全长以及其关键结构域不影响敲除细胞的增殖。3.裸鼠皮下成瘤实验发现:ITSN1-S能够促进胶质瘤细胞在裸鼠体内成瘤,而ITSN1-L不影响其体内成瘤;IHC显示移植瘤中Ki67的表达无统计学差异。三、ITSN1两亚型对胶质瘤细胞迁移侵袭的影响及ITSN1-L抑制胶质瘤细胞迁移侵袭的分子机制1.功能学实验结果表明:过表达全长ITSN1-L或者降表达ITSN1-S能够抑制细胞迁移侵袭运动能力;ITSN1-L的C2结构域过表达的细胞的迁移侵袭能力显著受到抑制,过表达ITSN1-L的DH-PH结构域的细胞的迁移侵袭能力未受影响,在ITSN1敲除细胞系中也得到类似的结果。2.对裸鼠皮下移植瘤组织切片行HE染色,发现HA-DH-PH-C2/LN229(6/28)和HA-C2/LN229(3/20)组移植瘤组织的侵袭频率低于对照组(16/30)。3.热图显示TCGA胶质瘤样本中ITSN1-L低表达组的MMP2与MMP9的表达水平几乎是高表达组的2倍;q RT-PCR结果显示,ITSN1-L的C2结构域过表达细胞中MMP2及MMP9的m RNA水平显著低于对照组。4.免疫共沉淀结果显示ITSN1-L与α-tubulin存在相互作用;Western blot及免疫荧光结果表明:ITSN1-L的C2结构域过表达细胞的ac-tubulin/α-tubulin水平显著低于对照组细胞。5.稳定降表达HDAC6或Tubacin处理组中ac-tubulin的表达显著升高,降表达SIRT2组中ac-tubulin的表达无明显变化;Tubacin处理不同时间后,两组细胞的ac-tubulin的累积速率无统计学差异,而Tubacin药物洗脱实验显示,ITSN1-L的C2结构域过表达组细胞的去乙酰化速率快。6.免疫荧光结果显示,Nocodazol处理细胞45 min后ITSN1-L的C2结构域过表达组细胞中ac-tubulin/α-tubulin的表达量低于对照组。7.降表达HDAC6或者Tubacin处理后能提高胶质瘤细胞迁移侵袭运动能力。四、ITSN1-L影响胶质瘤细胞粘附的关键结构域及分子机制1.粘附实验结果显示:与对照组相比,ITSN1-L C2结构域过表达组细胞与基质之间的粘附能力降低。EGF刺激不同时间后,ITSN1-L C2结构域过表达组细胞p-FAK和p-integrinβ3的相对含量明显低于对照组。2.功能学实验表明ITSN1-L C2结构域过表达细胞间粘附能力增强。热图显示ITSN1-L高表达组样本中CDH2(N-cadherin)的表达水平显著高于低表达组。Western blot和q RT-PCR显示,C2结构域过表达细胞中N-cadherin、Snail、Slug、Twist的表达升高,且N-cadherin和β-catenin在细胞膜上存在共定位,而对照组细胞中N-cadherin和β-catenin在细胞浆中呈弥漫性分布。3.免疫共沉淀结果显示ITSN1-L可与ANXA2蛋白相互作用;降表达ANXA2后细胞中N-cadherin、Snail、Slug、Twist的表达相应降低,细胞间粘附能力降低,同时细胞与基质之间的粘附能力提高。4.免疫共沉淀证实ITSN1-L与β-tubulin存在相互作用;Western blot和q RT-PCR显示ITSN1-L C2结构域过表达细胞中TUBB3和TUBB4的表达水平显著高于对照组;降表达TUBB3或TUBB4细胞后N-cadherin的表达未受影响,但N-cadherin的细胞膜定位比例降低,同时细胞间的粘附能力降低。结论1.通过对678例胶质瘤样本分析发现在胶质瘤的恶性进展中存在ITSN1的可变剪接方式的改变,并分析了ITSN1两个亚型的临床意义:ITSN1-L的m RNA表达与胶质瘤患者的预后负相关;ITSN1-S与ITSN1-L m RNA的表达比值与患者的预后正相关。2.胶质瘤细胞系及ITSN1敲除细胞系的细胞功能学实验和裸鼠体内移植瘤模型均证实,ITSN1两亚型对胶质瘤细胞的增殖影响不同:ITSN1-L不影响胶质瘤细胞的增殖,而ITSN1-S能够促进胶质瘤细胞的增殖。3.体内体外实验均证实,ITSN1两亚型在胶质瘤细胞迁移侵袭方面的功能截然相反:ITSN1-L的C2结构域能够抑制胶质瘤细胞的迁移、侵袭;而ITSN1-S与之相反。4.ITSN1-L的C2结构域能与微管蛋白α-tubulin结合,激活HDAC6依赖的ac-tubulin去乙酰化过程,破坏微管稳定性,从而抑制胶质瘤细胞的运动。5.ITSN1-L的C2结构域一方面可以通过抑制FAK/integrinβ3途径削弱细胞与胞外基质之间的粘附;另一方面能通过ANXA2上调N-cadherin表达,并由TUBB3/4介导N-cadherin从胞浆到胞膜的转位,从而增加细胞间的粘附。