论文部分内容阅读
目的臂丛根性撕脱伤(Brachial plexus roots avulsion,BPRA)是最严重的外周神经损伤之一。神经根丝从脊髓离断会导致脊髓相应节段前角运动神经元的大量死亡。周围神经损伤后,只有脊髓感觉和运动神经元存活才有机会发生轴突的再生和神经功能的修复。在干预神经损伤和再生进程的基础研究中,评估脊髓运动功能损伤程度和再生潜力的最重要指标是计数损伤和再生各个时期、以及药物治疗前后的受损节段脊髓前角运动神经元的存活数量。脊髓前角包括α和γ运动神经元,他们都属于胆碱能神经元,因此,公认典型的运动神经元标记物是胆碱乙酰转移酶(Choline acetlytransferase,Ch AT)。但是,在严重的周围神经损伤,比如臂丛的根性撕脱伤,损伤4周内这些仍然存活的或者正在凋亡的前角运动神经元均不表达Ch AT。而损伤4周内往往是实验干预神经再生的最佳时间窗,因此,必须寻找一个能评估辨别运动神经元的形态学方法。本实验用荧光金(Fluorogold,FG)逆行追踪脊髓运动神经元,建立单侧臂丛根性撕脱伤脊髓运动神经元损伤的成熟大鼠模型,应用免疫组化和免疫荧光双标的方法,研究神经元标志物—神经元核转录因子(Neuron specific nuclear protein,Neu N)、转录因子3(Activating transcriptional factor,ATF3)、和雌激素相关受体(Estrogen-related receptorγ,ERRγ)在脊髓前角运动神经元表达的时空模式,通过比较它们在正常侧和损伤侧脊髓前角运动神经元的表达差异,确定能标记创伤状态的脊髓前角运动神经元的分子标记物,为研究神经损伤和再生的研究提供可靠地实验方法。方法健康成年Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠(150g-200g),行大鼠腹侧入路右侧C5-T1全臂丛神经根撕脱伤手术,术后分别存活2w(n=5)、4w(n=5)处死。取C7-8节段脊髓制作冰冻切片,应用免疫组织化学、免疫荧光、western blot等方法,检测ERRγ蛋白和Neu N在脊髓前角和运动神经元的表达情况。用荧光金(FG)逆行标记脊髓的运动神经元胞体(Ax,n=5),其中5只标记手术3天后行背部入路臂丛根性撕脱伤手术(Ax+Av,n=5),撕脱C7-8神经根,存活1天后处死,取C7-8节段脊髓制作冰冻切片,免疫荧光观察FG标记和ATF3在前角运动神经元的表达情况;所有定量数据均记为均数±标准差(x±s),以中山大学统计学教研室提供的SPSS软件分析上述各指标的组间差异,分析ATF3或ERRγ表达程度与运动神经元存活的相关关系。以期明确ATF3、ERRγ在臂丛根性撕脱伤中的作用地位和相关机制。P≤0.05被认为有统计学意义。结果1.撕脱伤脊髓前角ERRγ蛋白表达的时空模式:ERRγ阳性反应主要分布在脊髓前角基底部、后角基底部及中央管周围。阳性反应颗粒主要存在于细胞核内。双侧脊髓Ⅸ层的ERRγ阳性运动神经元少见。免疫荧光双标发现在健侧脊髓,ERRγ和Neu N共表达于脊髓,前角基底部、后角基底部及中央管周围的神经元,脊髓前角大型的运动神经元多为Neu N阳性,而ERRγ阴性。仅有少数小中型的Neu N阳性神经元同时表达ERRγ。撕脱伤侧脊髓前角未见有Neu N阳性的大型运动神经元,可见极少数ERRγ阳性的小中型运动神经元。表明ERRr不能标记损伤的脊髓前角运动神经元。2.撕脱伤导致脊髓前角ERRγ蛋白表达减少:脊髓前角ERRγ阳性的神经元数目2W时间点时损伤侧为17.13±1.89,对照侧为24.12±5.32;4W时间点时损伤侧为23.03±1.38,对照侧为34.26±1.45。统计学分析结果表明,臂丛根性撕脱伤导致脊髓前角ERRγ阳性神经元减少:各时间点损伤侧数目均少于对照侧(P均<0.05),损伤4周时间点双侧的阳性神经元数目均高于2周时间(P均<0.05)。western blot半定量以及比较了健侧和损侧半脊髓节段的ERRγ蛋白水平发现,ERRγ基因蛋白表达与内参(GADPH)的灰度值比的结果显示,2W时间点时损伤侧为0.60±0.07,对照侧为0.74±0.09;4W时间点时损伤侧为0.63±0.07,对照侧为0.83±0.05。在不同的时间点损伤侧脊髓ERRγ表达量相对对照侧较低,且有显著性差异(P<0.05);但两个时间损伤侧脊髓ERRγ蛋白水平无显著性差异(P>0.05)。3.ATF3在臂丛根性撕脱伤脊髓前角运动神经元的表达模式:在撕脱伤侧脊髓C7-8节段的前角可见荧光金以点状分布在运动神经元的胞浆、胞核和突起内。而脊髓C7-8节段的背侧角和对照侧,则未发现FG阳性标记的神经细胞。ATF3阳性抗原只表达在损伤侧FG标记的前角神经元的细胞核中。以同侧脊髓的FG阳性运动神经元数目为100%,计算损伤侧运动神经元ATF3的阳性率(%),结果显示:Ax组为43.71%±6.43%、Ax+Av组为59.78%±5.54%,两组存在显著性差异(P<0.05),表明ATF3不仅能标记损伤的前角运动神经元还能反应运动神经元的损伤程度。4.臂丛撕脱伤导致损伤运动神经元不表达Neu N,而且使得ATF3表达增高:ATF3与Neu N免疫荧光双染色显示,术后2w、4w在脊髓C7-8节段,ATF3阳性反应均表达在损伤侧脊髓前角神经元细胞核中,对照侧脊髓未见表达ATF3的神经元;Neu N阳性反应在对照侧分布在全脊髓(脊髓背侧、腹侧角及中央管周围)的神经元的胞浆中,术后损伤侧脊髓Neu N阳性的神经元数量明显减少,4w时在脊髓腹侧角第Ⅸ层几乎检测不到Neu N的表达。定量分析结果:以对照侧脊髓的Neu N阳性神经元数目为100%,计算损伤侧ATF3阳性神经元的阳性率(%),结果显示随时间延长ATF3阳性神经元数目增多:撕脱伤2w为62.1%±3.07%;4w为75.2%±3.25%。结论1.在臂丛撕脱伤模型中ATF3特异的表达在受损的脊髓运动神经元内;2.Neu N的免疫荧光反应在臂丛根性撕脱伤后前4w的损伤侧脊髓前角的运动神经元内阳性反应消失,但同一脊髓切片的对照侧的运动神经元Neu N表达不受影响;3.在SD大鼠臂丛撕脱伤模型中ERRγ并不特异性的表达在γ运动神经元中,但是撕脱伤导致ERRγ蛋白的表达降低。