阿尔茨海默病(AD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病,其主要病理特征为脑内β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积形成老年斑(SP)和神经原纤维缠结(NFT),并伴有突触和神经元丢失等,严重损害认知功能,造成患者生活自理能力障碍和精神行为异常。研究表明老年斑的主要成分是Aβ, Aβ具有神经毒性,其在脑实质内沉积是AD发病的关键病理机制。中医理论认为AD发病由于肾虚髓亏,痰浊阻窍,故多用补肾填髓、化浊开窍法来治疗AD。益智方由淫羊藿、西洋参、枸杞、石菖蒲、天麻、川芎等6味药组成,方中淫羊藿、西洋参、枸杞补肾填髓；天麻、石菖蒲、川芎化浊开窍。本实验通过益智汤对APP695转基因小鼠的治疗作用环节及其机理研究,揭示补肾填髓、化浊开窍法治疗AD的作用机制,为中医临床治疗AD提供实验依据和增加新的内涵。本实验分为两部分：第一部分为整体实验,以13月龄APP695转基因小鼠为动物模型,随机分为模型组、益智汤治疗组,同月龄未经转基因处理的C57BL/6J小鼠做为正常对照组。益智汤组小鼠每天根据体重以益智汤(1ml/100g)灌胃,模型组和正常组给予等体积蒸馏水灌胃。益智汤治疗3个月后：(1)使用电迷宫、水迷宫检测各组小鼠学习记忆能力；(2)使用免疫组化技术和计算机图像分析技术测定各组小鼠大脑皮层、海马APP、Aβ1-40、Aβ1-42、Caspase3的表达情况；(3)应用ELISA技术定量测定各组小鼠脑组织和脑脊液Aβ1-42的浓度；(4)使用光镜和电镜观察各组小鼠脑组织的一般病理变化和超微结构病变；(5)末端转移酶介导的原位缺口末端标记染色(Tune1)法观察各组小鼠脑组织神经细胞凋亡情况。第二部分为离体实验,选取体外培养8天的胎鼠大脑皮质神经元,加入不同浓度已经老化处理的Aβ25-35(5、10、20及40μmol/L)作用后,MTT比色法和LDH漏出量检测各组神经细胞活力和细胞膜功能的影响,倒置显微镜下观察神经元形态变化,来选择合适浓度老化处理的Aβ25-35复制AD细胞模型。模型组细胞加入益智汤含药大鼠血清,选择相同的观察指标,观察益智汤大鼠血清对Aβ25-35损伤神经元的保护作用。主要实验结果如下：1.益智汤可改善APP695转基因小鼠行为学习和记忆能力Y型电迷宫显示模型组需要学习达标次数明显多于正常组,且记忆达标次数明显低于正常组(P＜0.01)。中药组所需达标次数少于模型组(P＜0.05),记忆能力明显改善(P＜0.01)。水迷宫结果显示模型组和中药组潜伏期多于正常组,进入盲端次数也多于正常组,与正常组有显著差异(P＜0.01,)。与模型组相比,中药组的潜伏期缩短,且进入盲端次数减少(P＜0.05)。说明16月龄APP695转基因小鼠学习记忆能力比正常对照组明显下降,较好地模拟了AD的行为学特征。中药益智汤能改善APP转基因模型小鼠的学习和记忆能力。2.益智汤可降低APP695转基因小鼠脑组织内APP、Aβ1-40和Aβ1-42的表达免疫组化结果显示模型组皮质和海马CA1区APP、Aβ1-40和Aβ1-42阳性神经细胞较正常组明显增加,且染色-加深,二者相比有显著差异。与模型组相比,中药组小鼠皮质和海马CA1区APP、Aβ1-40和Aβ1-42的阳性细胞较少,且着色变浅,二者相比有显著差异。ELISA试剂盒定量测定模型组小鼠脑组织和脑脊液中Aβ1-42的含量明显高于正常组,与正常组相比有极显著性差异。中药组小鼠脑组织和脑脊液中Aβ1-42的含量较模型组明显下降,说明益智汤治疗可以降低模型组小鼠脑组织APP、Aβ1-40和Aβ1-42的表达。3.益智汤可减轻APP695转基因小鼠脑组织超微结构的损伤光镜观察正常组小鼠大脑皮层组织结构清楚,神经细胞形态结构正常。而模型组小鼠大脑皮层和海马CA1区组织结构紊乱,神经元胞体缩小,胶质细胞增生；微血管管壁有炎性细胞分布,血管壁不整齐。中药组细胞排列较模型组整齐,形态较正常。电镜观察正常组大脑皮层神经元细胞膜完整清晰,核浆比例大,核内染色质分布均匀；细胞质内细胞器丰富,线粒体、突触结构清晰；有髓神经纤维的髓鞘连续、完整、均匀。模型组小鼠大脑神经元细胞膜部分模糊不清,细胞核膜内褶,染色质边聚；细胞质内细胞器减少,各级溶酶体及脂褐素增加；线粒体肿胀、嵴断裂、空泡样变,部分突触变性,突触前后膜及间隙模糊不清；有髓纤维髓鞘破碎不连续；毛细血管不规则,呈现局部管壁增厚。中药组超微结构病变比模型组减轻。4.益智汤减少APP695转基因小鼠脑组织的细胞凋亡免疫组化结果显示模型组小鼠脑组织Caspase3阳性细胞数量明显多于正常对照组,着色深度也强于正常对照组；而益智汤治疗组Caspase3阳性细胞数量较模型组较少,着色强度也弱于模型组。Tune1法显示模型组小鼠皮层、海马部位有较多Tune1强阳性细胞,说明模型组小鼠脑组织出现较多凋亡细胞。与模型组比较,中药组Tune1强阳性细胞明显减少,显示中药益智汤治疗可减少模型组小鼠脑组织Caspase3的表达及神经细胞的凋亡。5.益智汤可以减少Aβ对体外培养神经细胞的毒性作用培养胎鼠大脑皮质神经元细胞贴壁良好,分布均匀,结构清晰,突触间联系密切。加入Aβ25-35(5、10、20及40μmol/L)24h后,细胞生长状态不良,细胞肿胀变性,MTT检测细胞活性下降、LDH漏出率增加,随着Aβ25-35浓度的增加,细胞活性明显降低,LDH漏出率也明显增加,显示了Aβ25-35的毒性作用。选用10μmol/LAβ25-35复制AD细胞模型,加入益智汤治疗大鼠血清后,可以明显提高模型组细胞活力、降低LDH漏出率,改善细胞形态学异常。结论APP695转基因小鼠出现学习记忆能力减退,脑组织APP及Aβ表达增高,出现超微结构的病理改变及神经细胞凋亡,是较为理想的AD模型动物。益智汤可以降低模型组小鼠脑组织APP及Aβ的表达水平,改善其超微结构病理变化及抑制脑组织神经细胞凋亡,这是其改善APP695转基因小鼠学习记忆能力的基础。Aβ在脑微血管壁沉积,损伤血脑屏障,加重了Aβ的毒性作用,益智汤可以减轻血脑屏障的损伤。同时益智汤大鼠血清可以直接抑制Aβ的细胞毒性,发挥神经保护作用。以上结果说明益智汤通过多靶点减轻Aβ的毒性作用发挥神经保护功能,中药补肾填髓、化浊开窍法治疗AD具有实验依据。