克隆具有重要功能的，与恶性肿瘤、病毒感染和胚胎发育等相关的新基因并研究其功能 方法 采用交叉免疫学和数据库挖掘筛选、克隆、分析和研究新基因。前者基于SEREX，通过体外分离、培养人脐静脉内皮细胞，免疫新西兰大白兔获得含针对人内皮细胞蛋白的混合抗体，然后筛选非洲爪蟾的卵母细胞cDNA表达文库。筛选到的阳性克隆通过噬粒转化、核苷酸测序、生物信息学分析，确定要深入研究的对象。基因全长／完整ORF框的克隆主要通过基于生物信息学的电子克隆策略，包括EST序列拼接、基于基因组的直接预测等方法，最后设计引物通过RT-PCR验证电子克隆的正确性。 结果 1．交叉免疫学筛选：用人脐静脉内皮细胞免疫兔获得的抗血清筛选非洲爪蟾交叉免疫学筛选卵母细胞cDNA表达文库，共获得78个阳性克隆，代表51个不同的基因，信息学分析提示这些基因具有在进化上保守、参与多种基本的生命过程、表达比较广泛的特点。51个基因中有17个基因(33％)(40个克隆，51％)为已知的非洲爪蟾基因；34个基因(67％)(38个克隆，49％)为未知的非洲爪蟾基因，其中28个基因(55％)(32个克隆，41％)的人或小鼠基因功能已知，6个基因(12％)(6个克隆，8％)的人或小鼠的同源基因功能未知。依功能不同，这些基因可分为：XRHAMM，转录和翻译因子，参与肿瘤生物学过程的分子，信号转导分子，参与细胞运动、周期、增殖等过程的分子，分子伴侣和其它一些分子。阳性频率最高的是XRHAMM，共被筛选到18次，占总阳性克隆的23.1％，与细胞中心粒密切相关，在有丝分裂过程参与维持星状纺锤体极性的完整性。有13个基因(16.7％)与细胞分裂、周期、凋亡等过程相关，所以包括XRHAMM在内共有31个克隆的基因(39.8％)参与细胞生物学过程。其次为参与肿瘤生物学过程的基因，有17个基因，占21.8％。 2．基因全长／ORF的克隆和生物信息学分析：充分利用基因组学的研究成果，通过est序列拼接、基于基因组的直接预测方法等获得了非洲爪蟾PPAP基因(xPPAP)，斑马鱼VEGFD基因(zVEGFD)和C2H2型锌指蛋白基因(zKZF)完整的编码区序列，随后用RT-PCR扩增目的基因并测序以验证电子克隆的正确性。再用多种生物信息学手段分析这些基因的特点、预测其功能：1)xPPA2P基因是利用交叉免疫学筛选获得的一个功能未知的基因，获得全长859bp，编码82个氨基酸，生物信息学分析提示可能以分泌形式或单次跨膜形式存在，在脊椎动物内保守，所有的同源蛋白都不含丝氨酸和组氨酸，其表达与PERK和PKR关系十分密切，因此命名为PERK／PKR相关蛋白(PERK／PKR associated protein，PPAP)由此推断可能与抗病毒机制有关。2)人和小鼠的VEGFD基因与淋巴管生成和肿瘤的淋巴转移密切相关，为研究斑马鱼VEGFD基因在胚胎发育期对血液淋巴系统生成的影响，我们采用基于基因组序列的直接预测策略克隆了斑马鱼VEGFD基因的编码区序列，相似性分析表明zVEGFD与hVEGFD，mVEGFD和VEGFC具有较高(近40％)以上的相似性，而与zVEGFA相似性较低。3)从斑马鱼cDNA文库获得一条EST序列长647bp，分析发现其5’和3’端均不完整，采用基于基因组序列的直接预测和序列拼接策略，获得一长5171bp，编码1574个氨基酸的基因片断；该蛋白含有8个C2H2基序，与转录因子KAISO和KAlSO样蛋白相似性较高，提示可能为一新的转录因子，因此命名为KAISO样锌指蛋白(zebrafishKAISO-like zinc finger protein，zKZF)，但没有KAISO蛋白所有的BTB／POZ结构域，提示该蛋白功能与KAISO有所不同。 3．功能初步研究：根据以上生物信息学的分析结果，设计相应实验初步研究这三个新基因的功能。1)PPAP：为探讨其是否参与了哺乳动物细胞的抗病毒防御机制，我们采用293细胞扩增VSV病毒，然后按MOI=IO感染人Hela细胞，半定量RT-PCR发现VSV感染细胞4小时后PPAP在转录水平增高3.9倍，提示PPAP参与了早期的抗病毒抗与机制；2)zVEGFD：以EF-lα为内参，用半定量RT-PCR检测了zVEGFD在斑马鱼各发育时期的表达情况，结果显示，从1000细胞期到8体节期均未检测到zVEGFD的表达，从13体节期至成鱼开始表达，并于17体节期开始明显增加，与斑马鱼的血液淋巴系统的发育特点相符；3)zKLP：获取斑马鱼KAISO样锌指蛋白的全基因序列后，在翻译起始区域设计morpholino反义寡核苷酸抑制其表达，发现zKIP被抑制后，胚胎原肠胚期的细胞运动受到严重阻滞，最终胚胎在24小时内大部分死亡。结论交叉免疫学筛选的方法可以发现大量新的能引起交叉免疫反应的分子；联合采用基于基因组序列直接预测、est序列拼接的策略和RT-PCR，可以简便、快速的克隆新基因完整的ORF或全长；详细的生物信息学分析是揭示新基因功能的有力工具。