罗非鱼具有优良的生物学特性,能在恶劣的水质环境中生存,是一种重要的淡水养殖鱼类,也是我国南方地区重点推广养殖的优良品种之一。然而近年来随着罗非鱼养殖密度的提高、养殖水质的恶化,包括链球菌(Streptococcus sp.)、柱状黄杆菌(Flabobacterium columnare)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、鮰爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)等病原感染所引起的疾病已严重制约着罗非鱼养殖业的健康发展。其中,由海豚链球菌(Streptococcus iniae)和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)感染引起的链球菌病给罗非鱼养殖业造成的损失最为严重。我国2008年以前罗非鱼病害较少,且以海豚链球菌病为主,2009年在我国海南省大规模暴发罗非鱼无乳链球菌病之后,无乳链球菌就成为危害我国罗非鱼产业最严重的病原菌。研究发现,无乳链球菌对罗非鱼的致病性与温度密切相关,当水温超过32°C时较易引起罗非鱼链球菌病的流行和暴发。温度影响无乳链球菌对罗非鱼的致病机制尚不清楚。本文通过研究不同水温下无乳链球菌在罗非鱼体内的动态变化及培养温度对无乳链球菌毒力基因表达的影响来阐述温度介导无乳链球菌对罗非鱼的致病作用机制。主要的研究内容与结论如下:1不同水温下无乳链球菌在罗非鱼体内的动态分布和消除规律采用平板活菌计数的方法,以人工腹腔注射无乳链球菌的尼罗罗非鱼为研究对象,对25°C、29°C和33°C三个实验组罗非鱼进行无乳链球菌的体外分离、培养和计数,并分析感染无乳链球菌后随时间的延长不同实验组罗非鱼脑、肝脏、脾脏和肾脏四个组织中无乳链球菌的增殖和消除规律。结果显示,养殖水温越高,无乳链球菌在罗非鱼体内的增殖速度越快,达到浓度峰值时的浓度越高,达到浓度峰值后的消除速度越快,因此推测水温可以影响无乳链球菌在罗非鱼体内的增殖速度和存活时间。各实验组脾脏中无乳链球菌达到浓度峰值的量均显著高于同一实验组其它组织中无乳链球菌浓度峰值的量,推测脾脏是无乳链球菌入侵罗非鱼的靶器官。2不同水温下罗非鱼体内各组织中无乳链球菌的定量分析通过荧光定量PCR方法检测不同感染时间段25°C恒温组、25°C升温组、29°C恒温组、33°C恒温组和33°C降温组五个实验组罗非鱼肝脏、脑、肠、鳃、脾脏、头肾、体肾七个组织中病原菌浓度的变化规律。结果显示,罗非鱼感染无乳链球菌2 h后即可在不同实验组的七个组织中检测到无乳链球菌,因此推测无乳链球菌在罗非鱼体内的扩散速度较快;养殖水温越高,无乳链球菌在罗非鱼体内的繁殖速度越快、对罗非鱼的致死率也越高,温度的急剧升降也能够显著影响无乳链球菌的增殖速度及对罗非鱼的致死率,因此推测温度是影响无乳链球菌在罗非鱼体内繁殖速度的关键因素。33°C恒温组中头肾、肠道、脾脏中无乳链球菌浓度峰值的量均显著高于其它实验组同种组织中无乳链球菌浓度峰值的量,推测头肾、肠道和脾脏是无乳链球菌入侵罗非鱼的靶器官。本实验为深入研究温度对罗非鱼链球菌病致病机理的影响奠定基础。3不同培养温度对无乳链球菌毒力基因表达的影响通过对比不同培养温度下无乳链球菌的生长能力,结果显示无乳链球菌在体外的生长速度随着培养温度的升高而加快,达到对数生长期的时间也随之缩短,表明温度能够影响无乳链球菌的增殖速度。通过荧光定量PCR方法检测cfb、cylE、hylB、fbsA、bibA、pi-2b等无乳链球菌毒力基因在不同培养温度条件下的表达水平。实验结果显示,无乳链球菌的多个毒力基因的表达均受温度的影响。把无乳链球菌培养到稳定期后,cfb、fbsA、bibA、pi-2b和cylE等毒力基因的相对表达量随着培养温度的升高而升高;毒力基因hylB的相对表达量随着培养温度的升高而下降,因此推测温度能够通过影响无乳链球菌毒力基因的表达进而影响其对罗非鱼的致病力。