目的：　　 1、建立饥饿诱导的HeLa细胞自噬模型以及相应的检测指标体系,并以蛋白质组学技术筛选自噬后发生表达变化的线粒体蛋白质。　　 2、对筛选出的其中一个差异线粒体蛋白质mitofilin进一步进行验证,以确认其在自噬前后的差异表达。　　 3、探索mitofilin与自噬的关系。　　 方法：　　 1、HeLa细胞传代培养,采用饥饿法(以HBSS代替培养基)诱导HeLa细胞产生自噬。　　 2、HeLa细胞自噬检测:透射电镜检测自噬体的双层或多层膜结构形成；Westernblot检测正常HeLa细胞与自噬细胞的自噬体标记蛋白LC3。　　 3、HeLa细胞传代培养,至细胞总量达到约1×108个左右时,采用饥饿法(以HBSS代替培养基)诱导HeLa细胞产生自噬,用试剂盒提取正常组与自噬组HeLa细胞线粒体蛋白。　　 4、采用双向电泳(pH3-10)建立自噬状态下与正常状态下的线粒体差异蛋白质图谱。　　 5、利用PDQuest对双向图谱进行分析,筛选出差异蛋白。　　 6、采用LC/MS/MS质谱鉴定上述筛选到的差异蛋白并以Mascot等蛋白质搜索引擎检索Swissprot、NCBInr等数据库,获得蛋白质信息。　　 7、Western blot与Real-time PCR验证差异蛋白之一mitofilin在自噬前后的差异表达。　　 8、克隆mitofilin基因,将其插入pcDNA3.1(+)-HA质粒构建真核表达载体,并合成其siRNA片段。　　 9、构建将自噬体特异标记蛋白LC3基因克隆至真核表达载体pEGFP-C1并转染HeLa细胞,建立GFP-LC3/HeLa稳定细胞株,以便于对自噬相关蛋白的功能进行研究。　　 10、采用RNAi和过表达技术,结合饥饿诱导模型与自噬检测体系,检测mitofilin高表达/表达受阻的情况下是否诱导/抑制细胞自噬,从而研究其在自噬发生过程中的作用。　　 结果：　　 1、建立饥饿法诱导HeLa细胞产生自噬的模型及其检测体系,并摸索确定了线粒体提纯方法。　　 2、筛选得到了自噬状态下与正常状态下的部分差异线粒体蛋白质。　　 3、Western blot与Real-time PCR验证mitofilin在细胞发生自噬时在mRNA水平与蛋白水平均下调。　　 4、建立了稳定表达GFP-LC3的HeLa细胞株,为自噬相关蛋白质的功能研究提供了有利的实验模型。　　 5、初步的RNAi结果显示mitofilin很可能参与自噬进程。　　 结论：　　 1、成功地建立了饥饿法诱导HeLa细胞产生自噬的模型及其检测体系。　　 2、验证线粒体差异表达蛋白mitofilin,在细胞自噬时基因水平与蛋白水平均下调。　　 3、建立mitofilin的过表达与RNAi体系,为探索mitofilin与细胞自噬及线粒体功能的关系打下基础。