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研究背景:
胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiform，GBM)是成年人中最常见的原发恶性脑肿瘤。GBM患者的标准治疗包括最大限度的手术切除、术后放疗和替莫唑胺(Temzolomide，TMZ)化疗。尽管如此患者在初次确诊后其中位生存期仍然只有14.6个月。因此，亟需探究新的治疗方案来改善GBM患者的预后。
越来越多的证据表明胆固醇稳态失调与包括GBM在内的多种肿瘤的发展密切相关。然而流行病学数据分析发现GBM发生风险的高低和血清胆固醇水平并不完全相关，这表明血清胆固醇在GBM发展过程中的作用有限。羟固醇(Oxysterols)是一类胆固醇代谢过程中的氧化衍生物，在人体中羟固醇主要来自于饮食和自身的胆固醇代谢。它包括24-羟化胆固醇(24-Hydroxycholesterol，24OHC)，25-羟化胆固醇(25-Hydroxycholesterol，25OHC)、27-羟化胆固醇(27-Hydroxycholesterol，27OHC)和环状羟固醇(Oxysterols)。这些羟固醇不仅参与胆固醇的代谢过程，也参与调控Hedgehog，Wnt和MAPK信号通路。在神经退行性疾病和肿瘤中，羟固醇可以通过与肝脏X受体(Liver X receptors，LXRs)，羟固醇结合蛋白和胰岛素诱导基因1(Insulin-inducedgene 1，INSIG1)等特定的蛋白和转录因子结合之后调控胆固醇代谢和细胞增殖等过程。例如，最近有研究表明27OHC可以通过降低胞内胆固醇水平抑制前列腺癌的生长，但在乳腺癌中27OHC却可以诱导上皮间充质转化(Epithelial to mesenchymal transition，EMT)从而促进肿瘤生长。在一种早期肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)的亚型中，胆固醇稳态的失调则提示患者预后不良。而在GBM中，以下证据支持过量的胆固醇积累可以刺激肿瘤的生长:首先GBM通过上调低密度脂蛋白受体(Low density lipoprotein receptor, LDLR)的表达吞噬低密度脂蛋白(Low density lipoprotein, LDL)从而获取大量胆固醇;其次，GBM中缺少内源性羟固醇，这会导致胆固醇外排降低使GBM细胞积累大量胆固醇。目前为止在GBM中羟固醇减少导致胆固醇稳态失调的机制仍不明确。
在哺乳动物中，胆固醇稳态平衡受到以胆固醇调节元件结合蛋白(Sterol regulatory binding proteins，SREBPs)和LXRs两组转录因子为中心的一个复杂蛋白网络的精准调控，它们的下游靶基因参与胆固醇的输入，输出、合成、代谢和酯化。当胞内胆固醇降低时，SREBPs促进参与胆固醇合成和摄取的基因转录，例如3-羟-3-甲基戊二酰-CoA还原酶(3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,HMGCR)和LDLR。当细胞内胆固醇含量过高时LXRs开始发挥作用，一方面它可以诱导包括ATP结合盒转运体A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)和ATP结合盒转运体G1(ATP-binding cassette transporter G1，ABCG1)在内负责胆固醇外排基因的表达;另一方面它还可以通过上调E3泛素连接酶诱导型低密度脂蛋白受体降解器(Inducible degrader of the LDLR，IDOL)的表达促进LDLR的降解。研究证明在裸鼠原位成瘤模型中靶向这些信号通路是抑制GBM增殖的有效策略。
肿瘤细胞需要摄取大量胆固醇以维持其自身快速增殖，因此阻断细胞获取胆固醇或者增加胆固醇排泄可能是肿瘤治疗过程中的潜在靶点。然而，GBM中导致胆固异常醇积累的关键因素仍不清楚。本研究提取了全转录组数据库中的基因表达信息进行大规模生信分析确定了GBM中参与胆固醇稳态的差异表达基因。结果显示下调最明显的基因之一是胆固醇24-羟化酶(Cholesterol 24-hydroxylase，CYP46A1)，它是一个脑组织特异性酶，其功能是将胆固醇转化为24OHC从而将其排出中枢神经系统。在GBM患者中CYP46A1低表达提示患者预后不良，功能研究发现过表达或者药物激活CYP46A1/24OHC轴可以在体内外抑制GBM细胞的生长。我们的结果显示CYP46A1是介导GBM中胆固醇稳态失调的一个关键因素，靶向CYP46A1/24OHC可能为GBM治疗提供新的策略。
第一部分胆固醇在GBM增殖中的作用
目的
(1)探究GBM和正常脑组织之间的胆固醇代谢是否存在差异。
(2)明确胆固醇在GBM细胞增殖中的作用。
方法
(1)生物信息学分析正常脑组织和胶质瘤组织之间的胆固醇代谢差异。提取Rembrandt数据库中正常脑组织和胶质瘤标本的RNA测序数据进行GSEA，比较胆固醇代谢相关基因基因集在两者之间的表达差异。
(2)分别在GBM原代细胞和细胞系中检测胆固醇对细胞增殖的影响。进行挽救实验观察在缺乏胆固醇的培养液中补充外源性胆固醇是否可以部分挽救胆固醇缺乏导致的GBM细胞增殖抑制。
结果
(1)GBM和正常脑组织之间的胆固醇代谢方式存在明显差异。GSEA显示与正常脑组织相比，GBM组织中胆固醇合成代谢基因集表达较低，提示GBM的增殖可能更加依赖于摄取外源性胆固醇。
(2)胆固醇可以促进GBM细胞的增殖。在胆固醇缺乏的培养环境中GBM原代细胞和细胞系增殖均受到抑制，而在培养液中加入富含胆固醇的低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDL)则可以部分挽救这种胆固醇缺乏导致的增殖抑制。
结论
正常脑组织和GBM之间的胆固醇代谢存在明显差异，胆固醇是GBM细胞增殖过程中的一种必需物质。
第二部分CYP46A1在胶质瘤中的表达及作用机制
目的
(1)明确CYP46A1在胶质瘤中的表达情况及预后价值。
(2)揭示CYP46A1对GBM生长的影响。
(3)阐明CYP46A1在GBM恶性进展中发挥作用的机制。
方法
(1)分别提取Rembrandt和CGGA数据库中的胆固醇代谢相关基因的表达信息和临床病理信息，综合分析确定出差异表达最明显和预后价值最高的基因(CYP46A1)。提取TCGA数据库中的基因表达信息，分析CYP46A1在正常脑组织和不同级别的胶质瘤以及不同GBM亚型中的表达差异，进一步在不同数据库中验证CYP46A1的预后价值。
(2)免疫组化分析CYP46A1在不同级别胶质瘤标本中的表达差异。Westernblot分析其在正常人星形细胞和不同类型的GBM细胞中的表达差异。
(3)构建CYP46A1过表达慢病毒，分别感染GBM细胞系和GBM原代细胞。通过q-RT-PCR和Westernblot实验检测CYP46A1过表达效率。细胞计数和克隆形成实验体外观察过表达CYP46A1对细胞增殖的影响。
(4)构建GBM细胞系LN229和原代细胞GBM#P3裸鼠颅内成瘤模型，记录CYP46A1对于荷瘤小鼠生存期的影响。处死小鼠后HE染色观察CYP46A1对于肿瘤大小的影响。
(5)超高效液相色谱-质谱联用(Ultrahigh-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UHPLC-MS/MS)分析检测GBM组织和正常人脑组织中24OHC含量的差异。检测过表达CYP46A1后24OHC含量的变化。进行细胞活力，细胞凋亡、克隆形成、干细胞成球等实验评估24OHC对GBM细胞恶性生物学行为的影响。Westernblot检测24OHC刺激GBM细胞后相关指标的变化。
(6)分别通过试剂盒和菲律平染色检测24OHC刺激后胞内胆固醇的变化。进行细胞计数，细胞凋亡和干细胞成球实验观察补充胆固醇是否可以逆转24OHC刺激导致的GBM细胞恶性生物学行为的变化。RNA-Seq分析探究24OHC对于下游信号通路的影响并进行q-RT-PCR，Westernblot等实验验证。
结果
(1)CYP46A1是GBM中的一个抑癌基因。差异分析显示CYP46A1是正常脑组织和GBM之间表达差异最明显的胆固醇代谢相关基因之一，在胶质瘤患者中，CYP46A1低表达提示患者预后不良。数据库分析显示与正常脑组织相比CYP46A1的表达在GBM和LGG(Low grade glioma，LGG)中均显著降低，免疫组化(Immunohistochemistry, IHC)分析与上述结果一致。Westernblot分析表明与正常人星形胶质细胞(Normal human astrocyte，NHA)相比CYP46A1在GBM细胞中的表达明显降低。对GEO和ENCODE数据库中的染色质免疫沉淀测序(Chromosome immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq)数据分析后我们发现CYP46A1在GBM组织中低表达的原因是组蛋白异常修饰，并且我们用ChIP验证了上述结果。
(2)过表达CYP46A1抑制GBM细胞的增殖。q-RT-PCR和Westernblot分析显示慢病毒感染GBM细胞可以分别在mRNA和蛋白水平上调CYP46A1的表达。细胞计数、克隆形成和裸鼠颅内原位种瘤实验显示CYP46A1可以抑制GBM增殖。生存分析表明过表达CYP46A1可以显著延长小鼠的生存期。IHC分析表明过表达CYP46A1可以显著降低小鼠颅内GBM标本中的细胞增殖指标PCNA，增加细胞凋亡指标cleaved-caspase3的蛋白表达。
(3)CYP46A1催化产生24OHC抑制GBM的增殖和GSC的干性。UHPLC-MS/MS分析显示在GBM细胞中过表达CYP46A1可以显著增加其催化产物24OHC的含量;IC50实验观察到24OHC在较低浓度下即可对GBM细胞造成显著杀伤。流式细胞术分析发现24OHC可以显著增加GBM细胞的凋亡率。GBM细胞系的克隆形成能力和干细胞的成球能力随着24OHC浓度的增加而逐渐降低。Westernblot分析发现细胞凋亡标志物随着24OHC刺激浓度的增加逐渐上调，而细胞增殖标志物逐渐下调。
(4)24OHC通过降低GBM胞内胆固醇的含量抑制其恶性进展。试剂盒检测和菲律平染色表明24OHC刺激可以降低GBM细胞的胆固醇含量。补充外源性胆固醇则可以部分挽救24OHC刺激造成的细胞增殖的抑制和凋亡增加。在GBM原代细胞中补充胆固醇则可以挽救24OHC刺激导致的细胞成球能力的下降。
(5)24OHC通过LXR和SREBP1改变GBM中的胆固醇代谢。RNA-Seq表明24OHC调控的下游基因与胆固醇代谢信号通路密切相关;这些差异基因包括SREBP1下游靶基因LDLR和LXR的靶基因ABCA1以及胶质瘤干细胞标志物等。q-RT-PCR和Westernblot分析验证了上述RNA-Seq的结果。过表达SREBP1可以部分挽救24OHC刺激导致的细胞增殖抑制，使用SREBP1抑制剂刺激细胞发现GBM细胞的克隆形成能力明显减弱，胞内胆固醇含量显著降低，这与24OHC引起的效应是类似的。
结论
胶质瘤中CYP46A1表达降低是介导其胆固醇稳态失调的关键因素之一。在GBM细胞中过表达CYP46A1可以抑制GBM细胞的增殖。其分子机制是CYP46A1提高了24OHC的含量，24OHC一方面可以激动LXR并增加其下游外排胆固醇相关基因的转录，另一方面24OHC还可以抑制SREBP1的激活并降低其下游胆固醇摄取相关基因LDLR的表达。
第三部分依法韦仑通过激活CYP46A1/24OHC抑制胶质瘤增殖
目的
(1)研究CYP46A1激动剂依法韦仑在胶质瘤中的治疗价值。
(2)揭示CYP46A1激动剂依法韦仑抑制GBM增殖的机制。
方法
(1)UHPLC-MS/MS分析检测CYP46A1激动剂依法韦仑刺激胶质瘤原代细胞和胶质瘤细胞系后24OHC含量的变化。并通过菲律平染色和试剂盒检测依法韦仑对于胶质瘤原代细胞和细胞系胞内胆固醇含量的影响。
(2)IC50实验检测依法韦仑对胶质瘤细胞系和胶质瘤原代细胞的毒性。进行克隆形成实验、细胞凋亡实验、干细胞成球实验等体外评估依法韦仑对GBM细胞增殖，凋亡和干细胞特性的影响。Westernblot检测依法韦仑对胆固醇代谢相关指标，细胞凋亡指标、细胞增殖指标和肿瘤干细胞指标的影响。
(3)分别构建胶质瘤细胞系LN229和胶质瘤原代细胞GBM#3的裸鼠颅内成瘤模型，记录依法韦仑对小鼠生存期的影响，并通过小动物活体成像系统实时监测肿瘤生长情况。
结果
(1)依法韦仑可以降低GBM细胞的胞内胆固醇含量。试剂盒检测表明20μM依法韦仑分别刺激LN229和GBM#P3可显著降低细胞内总胆固醇含量。此外，菲律平染色显示10μM和20μM依法韦仑刺激可以显著降LN229和GBM#P3的胞内游离胆固醇含量。
(2)依法韦仑在体外通过提高24OHC含量对胶质瘤细胞有明显杀伤作用。IC50实验显示依法韦仑在较低浓度下即可对LN229(IC50=16.81μM)和GBM#P3(IC50=24.58μM)细胞有明显的杀伤效果。20μM依法韦仑刺激即可显著提高培养液中的24OHC浓度。进一步研究表明该药物可以显著抑制GBM细胞的克隆形成能力和干细胞成球能力并增加细胞凋亡，同时可以降低细胞增殖标志物PCNA和干细胞标志物SOX2的表达，并增加凋亡标志物c-PARP的表达。另一方面依法韦仑可以降低胆固醇摄取蛋白LDLR和转录因子SREBP1的蛋白水平，提高胆固醇外排蛋白ABCA1的蛋白含量。
(3)依法韦仑可以延长荷瘤小鼠生存期并抑制其肿瘤生长。在LN229和GBM#P3两种GBM颅内原位种瘤模型中，给与小鼠依法韦仑灌胃(0.1 mg/kg/day)可以显著延长荷瘤小鼠生中位存期(LN229:n=5，29天vs35天，P=0.02;GBM#P3:n=5，27天vs44天，P=0.007)，并且在GBM#P3模型中，小鼠活体成像分析显示给药组肿瘤荧光信号在21天显著降低(n=5，P=0.005)。同时免疫组化证实给药组细胞增殖标志物PCNA降低而凋亡标志物cleavedcaspase-3升高。
结论
CYP46A1激动剂依法韦仑可以通过激活CYP46A1增加胆固醇代谢产物24OHC的含量进而降低GBM细胞胞内胆固醇含量来抑制GBM细胞的增殖。
胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiform，GBM)是成年人中最常见的原发恶性脑肿瘤。GBM患者的标准治疗包括最大限度的手术切除、术后放疗和替莫唑胺(Temzolomide，TMZ)化疗。尽管如此患者在初次确诊后其中位生存期仍然只有14.6个月。因此，亟需探究新的治疗方案来改善GBM患者的预后。
越来越多的证据表明胆固醇稳态失调与包括GBM在内的多种肿瘤的发展密切相关。然而流行病学数据分析发现GBM发生风险的高低和血清胆固醇水平并不完全相关，这表明血清胆固醇在GBM发展过程中的作用有限。羟固醇(Oxysterols)是一类胆固醇代谢过程中的氧化衍生物，在人体中羟固醇主要来自于饮食和自身的胆固醇代谢。它包括24-羟化胆固醇(24-Hydroxycholesterol，24OHC)，25-羟化胆固醇(25-Hydroxycholesterol，25OHC)、27-羟化胆固醇(27-Hydroxycholesterol，27OHC)和环状羟固醇(Oxysterols)。这些羟固醇不仅参与胆固醇的代谢过程，也参与调控Hedgehog，Wnt和MAPK信号通路。在神经退行性疾病和肿瘤中，羟固醇可以通过与肝脏X受体(Liver X receptors，LXRs)，羟固醇结合蛋白和胰岛素诱导基因1(Insulin-inducedgene 1，INSIG1)等特定的蛋白和转录因子结合之后调控胆固醇代谢和细胞增殖等过程。例如，最近有研究表明27OHC可以通过降低胞内胆固醇水平抑制前列腺癌的生长，但在乳腺癌中27OHC却可以诱导上皮间充质转化(Epithelial to mesenchymal transition，EMT)从而促进肿瘤生长。在一种早期肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)的亚型中，胆固醇稳态的失调则提示患者预后不良。而在GBM中，以下证据支持过量的胆固醇积累可以刺激肿瘤的生长:首先GBM通过上调低密度脂蛋白受体(Low density lipoprotein receptor, LDLR)的表达吞噬低密度脂蛋白(Low density lipoprotein, LDL)从而获取大量胆固醇;其次，GBM中缺少内源性羟固醇，这会导致胆固醇外排降低使GBM细胞积累大量胆固醇。目前为止在GBM中羟固醇减少导致胆固醇稳态失调的机制仍不明确。
在哺乳动物中，胆固醇稳态平衡受到以胆固醇调节元件结合蛋白(Sterol regulatory binding proteins，SREBPs)和LXRs两组转录因子为中心的一个复杂蛋白网络的精准调控，它们的下游靶基因参与胆固醇的输入，输出、合成、代谢和酯化。当胞内胆固醇降低时，SREBPs促进参与胆固醇合成和摄取的基因转录，例如3-羟-3-甲基戊二酰-CoA还原酶(3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,HMGCR)和LDLR。当细胞内胆固醇含量过高时LXRs开始发挥作用，一方面它可以诱导包括ATP结合盒转运体A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)和ATP结合盒转运体G1(ATP-binding cassette transporter G1，ABCG1)在内负责胆固醇外排基因的表达;另一方面它还可以通过上调E3泛素连接酶诱导型低密度脂蛋白受体降解器(Inducible degrader of the LDLR，IDOL)的表达促进LDLR的降解。研究证明在裸鼠原位成瘤模型中靶向这些信号通路是抑制GBM增殖的有效策略。
肿瘤细胞需要摄取大量胆固醇以维持其自身快速增殖，因此阻断细胞获取胆固醇或者增加胆固醇排泄可能是肿瘤治疗过程中的潜在靶点。然而，GBM中导致胆固异常醇积累的关键因素仍不清楚。本研究提取了全转录组数据库中的基因表达信息进行大规模生信分析确定了GBM中参与胆固醇稳态的差异表达基因。结果显示下调最明显的基因之一是胆固醇24-羟化酶(Cholesterol 24-hydroxylase，CYP46A1)，它是一个脑组织特异性酶，其功能是将胆固醇转化为24OHC从而将其排出中枢神经系统。在GBM患者中CYP46A1低表达提示患者预后不良，功能研究发现过表达或者药物激活CYP46A1/24OHC轴可以在体内外抑制GBM细胞的生长。我们的结果显示CYP46A1是介导GBM中胆固醇稳态失调的一个关键因素，靶向CYP46A1/24OHC可能为GBM治疗提供新的策略。
第一部分胆固醇在GBM增殖中的作用
目的
(1)探究GBM和正常脑组织之间的胆固醇代谢是否存在差异。
(2)明确胆固醇在GBM细胞增殖中的作用。
方法
(1)生物信息学分析正常脑组织和胶质瘤组织之间的胆固醇代谢差异。提取Rembrandt数据库中正常脑组织和胶质瘤标本的RNA测序数据进行GSEA，比较胆固醇代谢相关基因基因集在两者之间的表达差异。
(2)分别在GBM原代细胞和细胞系中检测胆固醇对细胞增殖的影响。进行挽救实验观察在缺乏胆固醇的培养液中补充外源性胆固醇是否可以部分挽救胆固醇缺乏导致的GBM细胞增殖抑制。
结果
(1)GBM和正常脑组织之间的胆固醇代谢方式存在明显差异。GSEA显示与正常脑组织相比，GBM组织中胆固醇合成代谢基因集表达较低，提示GBM的增殖可能更加依赖于摄取外源性胆固醇。
(2)胆固醇可以促进GBM细胞的增殖。在胆固醇缺乏的培养环境中GBM原代细胞和细胞系增殖均受到抑制，而在培养液中加入富含胆固醇的低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDL)则可以部分挽救这种胆固醇缺乏导致的增殖抑制。
结论
正常脑组织和GBM之间的胆固醇代谢存在明显差异，胆固醇是GBM细胞增殖过程中的一种必需物质。
第二部分CYP46A1在胶质瘤中的表达及作用机制
目的
(1)明确CYP46A1在胶质瘤中的表达情况及预后价值。
(2)揭示CYP46A1对GBM生长的影响。
(3)阐明CYP46A1在GBM恶性进展中发挥作用的机制。
方法
(1)分别提取Rembrandt和CGGA数据库中的胆固醇代谢相关基因的表达信息和临床病理信息，综合分析确定出差异表达最明显和预后价值最高的基因(CYP46A1)。提取TCGA数据库中的基因表达信息，分析CYP46A1在正常脑组织和不同级别的胶质瘤以及不同GBM亚型中的表达差异，进一步在不同数据库中验证CYP46A1的预后价值。
(2)免疫组化分析CYP46A1在不同级别胶质瘤标本中的表达差异。Westernblot分析其在正常人星形细胞和不同类型的GBM细胞中的表达差异。
(3)构建CYP46A1过表达慢病毒，分别感染GBM细胞系和GBM原代细胞。通过q-RT-PCR和Westernblot实验检测CYP46A1过表达效率。细胞计数和克隆形成实验体外观察过表达CYP46A1对细胞增殖的影响。
(4)构建GBM细胞系LN229和原代细胞GBM#P3裸鼠颅内成瘤模型，记录CYP46A1对于荷瘤小鼠生存期的影响。处死小鼠后HE染色观察CYP46A1对于肿瘤大小的影响。
(5)超高效液相色谱-质谱联用(Ultrahigh-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UHPLC-MS/MS)分析检测GBM组织和正常人脑组织中24OHC含量的差异。检测过表达CYP46A1后24OHC含量的变化。进行细胞活力，细胞凋亡、克隆形成、干细胞成球等实验评估24OHC对GBM细胞恶性生物学行为的影响。Westernblot检测24OHC刺激GBM细胞后相关指标的变化。
(6)分别通过试剂盒和菲律平染色检测24OHC刺激后胞内胆固醇的变化。进行细胞计数，细胞凋亡和干细胞成球实验观察补充胆固醇是否可以逆转24OHC刺激导致的GBM细胞恶性生物学行为的变化。RNA-Seq分析探究24OHC对于下游信号通路的影响并进行q-RT-PCR，Westernblot等实验验证。
结果
(1)CYP46A1是GBM中的一个抑癌基因。差异分析显示CYP46A1是正常脑组织和GBM之间表达差异最明显的胆固醇代谢相关基因之一，在胶质瘤患者中，CYP46A1低表达提示患者预后不良。数据库分析显示与正常脑组织相比CYP46A1的表达在GBM和LGG(Low grade glioma，LGG)中均显著降低，免疫组化(Immunohistochemistry, IHC)分析与上述结果一致。Westernblot分析表明与正常人星形胶质细胞(Normal human astrocyte，NHA)相比CYP46A1在GBM细胞中的表达明显降低。对GEO和ENCODE数据库中的染色质免疫沉淀测序(Chromosome immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq)数据分析后我们发现CYP46A1在GBM组织中低表达的原因是组蛋白异常修饰，并且我们用ChIP验证了上述结果。
(2)过表达CYP46A1抑制GBM细胞的增殖。q-RT-PCR和Westernblot分析显示慢病毒感染GBM细胞可以分别在mRNA和蛋白水平上调CYP46A1的表达。细胞计数、克隆形成和裸鼠颅内原位种瘤实验显示CYP46A1可以抑制GBM增殖。生存分析表明过表达CYP46A1可以显著延长小鼠的生存期。IHC分析表明过表达CYP46A1可以显著降低小鼠颅内GBM标本中的细胞增殖指标PCNA，增加细胞凋亡指标cleaved-caspase3的蛋白表达。
(3)CYP46A1催化产生24OHC抑制GBM的增殖和GSC的干性。UHPLC-MS/MS分析显示在GBM细胞中过表达CYP46A1可以显著增加其催化产物24OHC的含量;IC50实验观察到24OHC在较低浓度下即可对GBM细胞造成显著杀伤。流式细胞术分析发现24OHC可以显著增加GBM细胞的凋亡率。GBM细胞系的克隆形成能力和干细胞的成球能力随着24OHC浓度的增加而逐渐降低。Westernblot分析发现细胞凋亡标志物随着24OHC刺激浓度的增加逐渐上调，而细胞增殖标志物逐渐下调。
(4)24OHC通过降低GBM胞内胆固醇的含量抑制其恶性进展。试剂盒检测和菲律平染色表明24OHC刺激可以降低GBM细胞的胆固醇含量。补充外源性胆固醇则可以部分挽救24OHC刺激造成的细胞增殖的抑制和凋亡增加。在GBM原代细胞中补充胆固醇则可以挽救24OHC刺激导致的细胞成球能力的下降。
(5)24OHC通过LXR和SREBP1改变GBM中的胆固醇代谢。RNA-Seq表明24OHC调控的下游基因与胆固醇代谢信号通路密切相关;这些差异基因包括SREBP1下游靶基因LDLR和LXR的靶基因ABCA1以及胶质瘤干细胞标志物等。q-RT-PCR和Westernblot分析验证了上述RNA-Seq的结果。过表达SREBP1可以部分挽救24OHC刺激导致的细胞增殖抑制，使用SREBP1抑制剂刺激细胞发现GBM细胞的克隆形成能力明显减弱，胞内胆固醇含量显著降低，这与24OHC引起的效应是类似的。
结论
胶质瘤中CYP46A1表达降低是介导其胆固醇稳态失调的关键因素之一。在GBM细胞中过表达CYP46A1可以抑制GBM细胞的增殖。其分子机制是CYP46A1提高了24OHC的含量，24OHC一方面可以激动LXR并增加其下游外排胆固醇相关基因的转录，另一方面24OHC还可以抑制SREBP1的激活并降低其下游胆固醇摄取相关基因LDLR的表达。
第三部分依法韦仑通过激活CYP46A1/24OHC抑制胶质瘤增殖
目的
(1)研究CYP46A1激动剂依法韦仑在胶质瘤中的治疗价值。
(2)揭示CYP46A1激动剂依法韦仑抑制GBM增殖的机制。
方法
(1)UHPLC-MS/MS分析检测CYP46A1激动剂依法韦仑刺激胶质瘤原代细胞和胶质瘤细胞系后24OHC含量的变化。并通过菲律平染色和试剂盒检测依法韦仑对于胶质瘤原代细胞和细胞系胞内胆固醇含量的影响。
(2)IC50实验检测依法韦仑对胶质瘤细胞系和胶质瘤原代细胞的毒性。进行克隆形成实验、细胞凋亡实验、干细胞成球实验等体外评估依法韦仑对GBM细胞增殖，凋亡和干细胞特性的影响。Westernblot检测依法韦仑对胆固醇代谢相关指标，细胞凋亡指标、细胞增殖指标和肿瘤干细胞指标的影响。
(3)分别构建胶质瘤细胞系LN229和胶质瘤原代细胞GBM#3的裸鼠颅内成瘤模型，记录依法韦仑对小鼠生存期的影响，并通过小动物活体成像系统实时监测肿瘤生长情况。
结果
(1)依法韦仑可以降低GBM细胞的胞内胆固醇含量。试剂盒检测表明20μM依法韦仑分别刺激LN229和GBM#P3可显著降低细胞内总胆固醇含量。此外，菲律平染色显示10μM和20μM依法韦仑刺激可以显著降LN229和GBM#P3的胞内游离胆固醇含量。
(2)依法韦仑在体外通过提高24OHC含量对胶质瘤细胞有明显杀伤作用。IC50实验显示依法韦仑在较低浓度下即可对LN229(IC50=16.81μM)和GBM#P3(IC50=24.58μM)细胞有明显的杀伤效果。20μM依法韦仑刺激即可显著提高培养液中的24OHC浓度。进一步研究表明该药物可以显著抑制GBM细胞的克隆形成能力和干细胞成球能力并增加细胞凋亡，同时可以降低细胞增殖标志物PCNA和干细胞标志物SOX2的表达，并增加凋亡标志物c-PARP的表达。另一方面依法韦仑可以降低胆固醇摄取蛋白LDLR和转录因子SREBP1的蛋白水平，提高胆固醇外排蛋白ABCA1的蛋白含量。
(3)依法韦仑可以延长荷瘤小鼠生存期并抑制其肿瘤生长。在LN229和GBM#P3两种GBM颅内原位种瘤模型中，给与小鼠依法韦仑灌胃(0.1 mg/kg/day)可以显著延长荷瘤小鼠生中位存期(LN229:n=5，29天vs35天，P=0.02;GBM#P3:n=5，27天vs44天，P=0.007)，并且在GBM#P3模型中，小鼠活体成像分析显示给药组肿瘤荧光信号在21天显著降低(n=5，P=0.005)。同时免疫组化证实给药组细胞增殖标志物PCNA降低而凋亡标志物cleavedcaspase-3升高。
结论
CYP46A1激动剂依法韦仑可以通过激活CYP46A1增加胆固醇代谢产物24OHC的含量进而降低GBM细胞胞内胆固醇含量来抑制GBM细胞的增殖。