论文部分内容阅读
纤溶酶原激活剂抑制物-1(PlasminogenActivatorInhibitor-1,PAI-1)属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员,其结构与其它丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员相似,有含精氨酸的活性中心和与蛋白水解酶结合的伪作用底物。在生理情况下,PAI-1与组织型和尿激酶型纤溶酶原激活剂结合,从而抑制了纤溶酶原向纤溶酶的转化。它是纤溶系统的主要抑制因子,在溶解纤维蛋白和组织蛋白水解过程中发挥着重要的作用。PAI-1与蛋白水解相关的功能主要有血管生成、抑制血浆纤溶依赖的金属蛋白酶活性等。
肥胖是心血管疾病发生的重要危险因子,与动脉粥样硬化、中风和充血性心肌梗死密切相关。患者血浆PAI-1浓度的增高是一个重要的生物标签,可以解释肥胖及代谢综合症病人增加血管栓塞风险的原因。最近的研究表明,PAI-1直接影响肥胖的并发症,包括心脏动脉栓塞和2型糖尿病,甚至还影响内脏脂肪的堆积。血浆PAI-1浓度的升高是心血管疾病发生的主要指标和再发性心肌梗塞和深静脉血栓的前兆。3T3-L1细胞株是最常用的体外模拟脂肪细胞分化的模型,生长至接触抑制的前脂肪细胞诱导后重新进入细胞周期,经历两轮左右的有丝分裂后,细胞进入分化的终末阶段。
本研究中3T3-L1前脂肪细胞按标准的诱导方案完全地分化为成熟的脂肪细胞,细胞的数目增多和细胞的体积随着细胞内的脂滴增多而变大。脂肪细胞分化的特异标志分子如过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PeroxisomeProliferator-ActivatedReceptorγ,PPARγ)和422/aP2随着细胞的分化而表达。在脂肪细胞分化过程中,PAI-1的表达随着脂肪细胞的分化而增加(包括蛋白质水平和mRNA水平),与PPARγ的表达及其调控的目标基因422/aP2密切相关。
通过对PAI-1启动子的连续缺失体转染分化第2天的脂肪细胞后报告基因活性分析,结果发现PAI-1启动子的报告基因活性在加入PPARγ的特异性配体吡格列酮(Pioglitazone)后上调,提示PPARγ在转录水平调节PAI-1的表达。当启动子缺失了-235bp至-178bp区间时,PPARγ对PAI-1启动子活性的诱导作用消失。
综合生物信息学分析和参考以往的文献发现,PAI-1启动子可能存在一个不典型的过氧化物酶体增殖物激活受体反应元件(PeroxisomeProliferator-ActivatedReceptorResponsiveElement,PPRE),即不典型的PPRE(PPRE-like)碱基序列(TCCCCCATGCCCT)。凝胶电泳迁移分析(ElectrophoreticMobilityShiftAssay,EMSA)的实验结果表明,此段序列可与脂肪细胞核抽提物结合,结合条带的位置与经典的PPRE(ConsensusPPRE)电泳迁移位置相近;未标记的PAI-1不典型PPRE和经典的PPRE冷探针可以完全竞争抑制这种结合反应;而且经吡格列酮处理后的脂肪细胞核抽提物的特异性结合反应明显增强;进一步用抗体阻滞迁移(Supershift)实验证明了PPARγ与不典型PPRE之间的相互作用关系。但是PAI-1启动子的不典型PPRE探针与前脂肪细胞核抽提物不发生结合。
在前脂肪细胞中,共转染PPARγ和类视黄醇X受体a(RetinoidXReceptora,RXRa)时,野生型PAI-1的启动子活性明显增高(TCCCCCATGCCCT);加入PPARγ特异性配体吡格列酮后,启动子报告基因活性进一步上调;而突变型PAI-1启动子(TCTCGATTGCCAT)报告基因活性没有明显变化。
转染分化第2天的脂肪细胞(已有内源性PPARγ的表达),野生型PAI-1启动子报告基因在加入吡格列酮后,活性明显增加;突变了PAI-1不典型PPRE后,吡格列酮诱导启动子活性增加的作用也消失。
用PPARγ特异性配体吡格列酮处理分化第2天的脂肪细胞,Westernblotting分别检测细胞和培养液上清,结果发现PAI-1的表达和分泌明显增多。
因此,在脂肪细胞分化过程中,不典型PPRE(-206bpTCCCCCATGCCCT-194bp)在PAI-1基因的表达调控方面起着重要作用。人PAI-1基因启动子也存在与不典型PPRE相似的碱基序列(-987bpTCCCCTCACCCCCT-974bp),提示在肥胖形成过程中,脂肪细胞分化的重要转录因子PPARγ通过作用PAI-1基因启动子的不典型PPRE而上调PAI-1表达。
临床上使用噻唑烷二酮(Thiazolidinediones,TZDs)类药物治疗2型糖尿病发现,患者血浆中PAI-1水平下降,但其分子作用机制未明。目前认为TZDs治疗后改善了患者体内的炎症状态,促进PAI-1表达的基因下调,从而降低了血浆中PAI-1水平。有资料发现,TZDs处理成熟脂肪细胞导致磷酸化的PPARγ通过泛素-蛋白酶体途径降解增加。本研究结果表明,分化第10天的成熟脂肪细胞经吡格列酮和胰岛素长时间处理后,PPARγ明显下降,同时PAI-1的分泌也显著减少。进一步解释临床上TZDs类药物治疗胰岛素抵抗病人后,血浆PAI-1水平下降的分子机制。