弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma, DLBC L)是一组高度侵袭性的淋巴瘤,在成人非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NH L)中约占30-40%,是NHL中最常见的亚型。DLBCL可原发于淋巴结或结外组织器官,也可由慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma, FL)等低度恶性淋巴瘤转化而来。作为高度侵袭性的淋巴瘤,DLBCL在细胞遗传学、分子生物学、组织形态学、临床表现及预后等方面均存在很大的异质性。尽管由美罗华联合环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松(R-CHOP)的一线方案,显著提高了DLBCL患者的治疗效果,但仍有约40%的患者难治、复发导致死亡。因此,深入研究DLBCL的生物学异质性和侵袭机制,对于开发特异性治疗靶点、优化一线治疗方案的选择、提高完全缓解率、改善患者预后具有重要意义。异黏蛋白(metadherin, MTDH)是近年来发现的一个新的癌基因,又称为星状细胞上调基因-1(Astrocyte elevated gene-1, AEG-1)。最早是在研究人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus-1, HIV-1)感染相关脑病时发现的新基因,命名为AEG-1。后来从侵袭性较高的乳腺癌细胞株中克隆出该蛋白,并且同时发现该蛋白能够促进乳腺癌细胞向肺部转移,从而命名该蛋白为MTDH。人类的MTDH基因位于染色体8q22,基因全长3611bp,编码产物是一种跨膜蛋白,包含582个氨基酸,分子量64KD。目前,已有大量的研究表明,MTDH在全身多种肿瘤中高表达,如乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌、前列腺癌、肾癌、结肠癌、神经胶质瘤、胆囊癌、卵巢癌、淋巴瘤等。且进一步的研究证实,MTDH能够通过调节PI3K/AKT、NF-κB、Wnt/β-catenin等多个信号传导通路及其相关基因的表达水平,来调控肿瘤的生长增殖、血管生成、侵袭转移及耐药等。同时,近年来发现,上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)与肿瘤细胞的局部浸润和远处转移密切相关。EMT是指上皮细胞在特定生理或病理情况下向间质细胞转化,并伴随明显基因和表型改变的一个多阶段过程。肿瘤细胞发生EMT时,细胞的形态、极性、迁移侵袭能力等形态学和生物学行为会出现变化,同时伴有上皮标志物E-cadherin等表达减低和功能缺失,间质细胞标志物β-catenin、vimentin等过量表达,以及某些转录因子Snail、Twist和ZEB1等表达和/或功能上调。在乳腺癌、肺癌、肝细胞癌、头颈鳞癌、骨肉瘤、结肠癌及子宫颈癌等多种恶性肿瘤中已证实,MTDH可以通过调节肿瘤细胞的EMT来促进肿瘤的侵袭转移。MTD H与EMT标志物的表达和肿瘤分化、临床分期、治疗预后密切相关。MTDH促进肿瘤细胞发生EMT,是通过调控多种信号通路来实现的,如：PI3K/AKT、Wnt/p-catenin、NF-κB和MAPK等信号通路,从而来调控肿瘤的侵袭性。其中Wnt/β-catenin是 MTDH发挥作用的一条重要信号通路,该通路在调控胚胎发育,维持成体组织细胞自我更新平衡中起重要作用,其异常激活与肿瘤的发生发展有关。该信号通路中的β-catenin在EMT和激活Wnt信号通路方面起到双重作用。DLBCL为高度侵袭性淋巴瘤,易出现结外侵犯,DLBCL中是否存在EMT现象、MTDH与EMT在DLBCL侵袭性中的作用及调控机制如何,目前尚不清楚。本研究应用免疫组织化学、细胞生物学及基因沉默等技术,阐明了MTDH和EMT在DLBCL中的表达情况及二者的调控关系,探讨了MTDH表达变化对DLBCL细胞侵袭性的影响和调控机制,为开发新的DLBCL分子标志物和治疗靶点提供了依据。第一部分MTDH和EMT标志物在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达及临床意义目的：DLBCL为高度侵袭性淋巴瘤,存在很大的异质性,但对其侵袭机制的研究尚不清楚。MTDH是近年来发现的一个新的癌基因。大量研究表明,MTDH在全身多种肿瘤中高表达,并通过调节PI3K/AKT、NF-κB、Wnt/β-catenin等多个信号传导通路及其相关基因的表达水平,来调控肿瘤的生长增殖、血管生成、侵袭转移及耐药等。EMT与肿瘤细胞的局部浸润和远处转移密切相关。肿瘤细胞发生EMT时,其生物学行为和分子标志物会出现改变。MTDH可以通过调节肿瘤细胞的EMT来促进肿瘤的侵袭转移。为了研究MTDH口EMT在DLBCL中的表达情况,我们以人DLBCL细胞株LY1和LY8为研究对象,首先采用蛋白印记分析技术检测MTDH和EMT标志物vimentin、ZEB1蛋白在DLBCL细胞株中的表达情况。并收集病理诊断明确的DLBCL和淋巴结反应性增生的组织标本,应用免疫组织化学技术对MTDH在两组织中的表达情况进行检测,并与患者的临床资料进行相关性分析,探讨它们在DLBCL侵袭性中的作用。材料与方法：1.标本收集和分离外周血单个核细胞2.LY1和LY8细胞株培养3.蛋白提取与蛋白印迹分析4.标本和临床病例资料收集5.免疫组织化学分析6.统计学分析结果：1. Western blot结果显示,MTDH、vimentin和 ZEB1蛋白在DLBCL细胞株中均高表达,而在对照正常人外周血单个核细胞中几乎不表达。MTDH的目的条带位于75kD处,vimentin的目的条带位于54kD处,ZEB1的分子量最大,目的条带位于124kD处。2.30例DLBC L组织标本中只有1例评分为0,40.0%(12/30例)的DLBCL组织标本中MTDH为低表达,60.0%(18/30例)的DLBCL组织标本中MTDH为高表达,表达的MTDH染色多见于细胞浆,也可少量见于细胞核中。而MTDH在淋巴结反应性增生组织中几乎不表达。3. MTDH的表达与DLBCL患者临床特征的相关性分析结果显示,MTDH的高表达与DLBCL患者的年龄(P=0.458)、性别(P=0.284)、LDH (P=0.249)无相关性,而与临床分期(P=0.04)、有B症状(P=0.004)、危险度分层(P=0.033)呈正相关,P值均<0.05,有统计学意义。结论：1.本研究通过Western blot技术的检测,发现MTDH、vimentin和 ZEB1蛋白在DLBCL细胞株中均高表达。2.IHC结果显示,60.0%(18/30例)的DLBCL组织中MTDH为高表达,表达的MTDH多位于细胞浆中,少量见于细胞核中。3. MTDH的高表达与DLBCL患者的临床分期、有B症状和危险度分层呈正相关。第二部分MTDH表达变化对弥漫大B细胞淋巴瘤侵袭性的影响及其调控机制目的：在多种恶性肿瘤中证实,MTDH可以通过调节肿瘤细胞的EMT来促进肿瘤的侵袭转移。MTDH与EMT标志物的表达和肿瘤分化、临床分期、治疗预后密切相关。MTDH是通过调控PI3K/AKT, NF-κB. Wnt/β-catenin和MAPK等多种信号通路来促进肿瘤细胞EMT的发生,从而调控肿瘤的侵袭性。本研究以人DLBCL细胞株LY8为研究对象,应用慢病毒载体介导的RNAi沉默MTDH基因,然后检测EMT标志物vimentin和ZEB1蛋白的表达变化和DLBCL细胞侵袭能力的改变。进一步研究在DLBCL中是否存在EMT现象,以及MTDH表达变化对DLBCL细胞侵袭性的影响和调控机制。材料与方法：1.LY8细胞株培养2.慢病毒载体介导的RNAi靶向沉默LY8细胞株的MTDH基因3.流式细胞术检测细胞转染率4.蛋白提取及蛋白印迹分析5.侵袭小室实验6.统计学分析结果：1.慢病毒载体介导的MTDH RNAi可以抑制DLBCL细胞中MTDH的表达。2.应用慢病毒颗粒沉默MTDH基因后,DLBCL细胞中Vimentin和ZEB1蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)3. Transwell侵袭小室实验结果显示,慢病毒载体介导的MTDH基因沉默可以降低DLBCL细胞株的迁移力和侵袭力(P<0.05)。结论：1. DLBCL中存在类EMT现象。2. MTDH基因沉默可以降低EMT标志物Vimentin 和 ZEB1蛋白在DLBCL细胞株中的表达。3.抑制MTDH的表达可以降低DLBCL细胞株的迁移力和侵袭力。4.MTDH可能是通过Wnt/β-catenin信号通路调节DLBCL的EMT。