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本研究以猪伪狂犬病毒(PRV)Fa株的毒种为材料,扩增克隆gL基因,同时利用所获得的目的基因进行原核表达载体构建、表达及真核表达载体构建及免疫效力的研究,主要研究内容如下:1、PRV gL基因的分子克隆与序列分析参照GenBank中登录号为NC006151的PRV Fa株的gL基因序列,利用Oligo6.0和Premier软件辅助设计1对引物,以Vero细胞增殖培养的PRV为材料,采用PCR技术扩增gL基因,用TA克隆法连接到pMD18-T-vector载体上,构建克隆重组质粒pMD-gL。并将阳性菌送公司测序,序列测定显示,克隆出503bp片段,包含1个471bp的ORF框,编码127个氨基酸。将测序结果及推导的氨基酸序列与国内外的不同来源的5个毒株进行生物学信息比较分析,克隆的gL基因核苷酸序列同源性在96%～100%,氨基酸同源性在96.3%～98.8%,不同的PRV毒株间的gL基因在核苷酸水平和氨基酸水平上是高度保守的。2、PRV gL基因原核表达载体构建及活性检测为了去除gL基因的信号肽(gL-n),重新设计1对引物,以pMD-gL为模板,采用亚克隆技术扩增目的基因,用TA克隆法连接到pMD18-T载体上,构建克隆重组质粒pMD-gL-n,将酶切鉴定正确的阳性菌送公司测序,测序结果与模板中去掉信号肽的对应序列完全一致。用EcoRI和SalI限制性内切酶切下目的基因(gL-n),再定向连接到pET32a(+)中,获得重组原核表达载体pET-gL-n。酶切鉴定正确后转化到高效表达菌株E.coliBL21(DE3)进行表达研究。经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测显示,约在39KDa处出现一条特异表达带,原核重组表达载体pET-gL-n表达获得预期的融合目的蛋白,Western Blot检测显示表达的去信号肽融合蛋白具有特异的反应原性。3、PRV gL基因核酸疫苗构建及其免疫效力的研究从克隆质粒pMD-gL中酶切出gL基因,并与酶切回收的真核表达载体pCI-neo定向连接,构建真核表达质粒pCI-gL,并将其电转化入减毒猪霍乱沙门氏菌S.C500。将30只小鼠随机分成3组,每组10只,分别是空白对照,S.C500/pCI-neo空质粒组,S.C500/pCI-gL重组质粒组。每2周进行一次灌胃免疫,共4次。对照组小鼠每次灌胃10%碳酸氢钠0.2mL,其余两组用分别用10%碳酸氢钠重悬细菌至10~9个/0.2mL后灌胃0.2mL。首免后第2、4、6、8周采血分离血清,间接ELISA方法检测抗体水平。末次采血后小鼠腹腔注射0.2mL稀释的PRV(200TCIDSO/0.1 ml)。ELISA结果显示,以减毒沙门氏菌为运送载体的pCI-gL口服DNA疫苗具有一定的免疫原性,可以刺激小鼠机体产生一定水平的抗体。攻毒保护实验证实本疫苗对小鼠有一定的保护力,可以在200TCID50/0.1 ml攻毒后,致使对照组全死的情况下保护约70%的小鼠存活。