青光眼、视神经外伤、视网膜色素变性等疾病是眼科临床中高发的不可逆致盲性眼病,极大地危害了患者的身心健康。由于在成年哺乳动物中,损伤的视网膜神经细胞无法再生,故治疗效果差,治疗手段有限,是临床上的一大难题。本研究从两方面着手：一是神经轴突受损而神经元胞体还存活的病理状况,我们致力于通过研发组织工程神经导管促进成年哺乳动物体内的视神经轴突再生来修复：另一方面是神经细胞也损伤失活、残存的神经细胞不足以维持正常神经功能的病理状况,我们将成年哺乳动物体内的内源性因子ephrinA3作为靶点,研究其对视网膜干细胞增殖和分化的调节作用,从而为治疗各种累及视网膜神经细胞的疾病打下基础。第一部分：一种新的组织工程化导管移植促进成年大鼠视神经再生的实验研究目的：通过研发一种新的可降解的组织工程化导管,移植在损伤的视神经断端促进成年大鼠的视神经轴突生长,从而探索外源性微环境改变对促进视神经再生的作用。方法：(1)制备转基因雪旺细胞：构建GFP-CNTF真核细胞表达质粒,用电穿孔法将其转染培养的雪旺细胞,在转染后3小时—7天在荧光显微镜下观察绿色荧光的表达时间和转染效率。在细胞转染CNTF后24小时,用RT-PCR检测CNTF的mRNA表达情况,并且用免疫组化检测CNTF蛋白的表达情况,从而证实基因的转染效果。(2)制备组织工程化导管：用PGA细丝填充于中空的PLGA导管中,然后分别将转染CNTF的雪旺细胞或单纯雪旺细胞填充入导管,并过夜培养,使细胞更好地贴附。(3)动物实验：用成年SD大鼠,分成3组,每组6-8只,分别为：①转基因雪旺细胞导管组、②雪旺细胞导管组、③空导管组。首先手术造成大鼠视神经横断伤,然后将各种导管缝合至大鼠视神经近侧断端。(4)评价再生效果：导管移植4周后,用再生轴突标记物GAP-43抗体标染各组导管的冰冻切片,每张切片从视神经断端开始,每625微米作为一个计数点,每只大鼠取5张切片进行计数并取得每个距离计数点再生轴突的平均数,然后对每个距离计数点的再生轴突数量在三个实验组之间用One Way Anova进行统计分析。同时,用透射电镜观察导管内部雪旺细胞的存活和再生轴突的微细结构。(5)观察导管炎症及降解情况：用巨噬细胞和小胶质细胞标记物OX42抗体标染导管冰冻切片以观察导管内炎症反应的情况,并在移植后4周和2个月观察导管材料的降解情况。结果：(1)成功制备转基因雪旺细胞：测序证明GFP-CNTF质粒构建成功,将质粒转染雪旺细胞后3小时绿色荧光开始表达,24小时达到高峰,可持续一周。将质粒转染雪旺细胞24小时后,RT-PCR结果可见转染CNTF的雪旺细胞有较高的CNTF mRNA表达,免疫组化结果显示转染CNTF的雪旺细胞表达CNTF,从而证实了该基因转染方式的有效性。(2)GAP43免疫组化计数再生神经纤维：将三种导管移植在成年大鼠视神经横断伤末端4周后,用GAP43标染组织工程化导管内的再生神经纤维。在距离视乳头1875μm的导管内部,单纯雪旺细胞导管组再生轴突的数量(14.3±2.94/mm/section)和转染CNTF的雪旺细胞导管组再生轴突的数量(16.2±1.56/mm/section)明显高于对照空导管组(5±2.06/mm/section, P＜0.05, one way anova, n=6或8).说明该组织工程化导管填充雪旺细胞后具有明显的促进视神经再生的作用。在离视神经断端约5000μm的导管内部,转基因雪旺细胞导管组的再生轴突数量为4.23±1.18/mm/section,而单纯雪旺细胞导管组的再生轴突数量为1.33±0.58/mm/section,两组之间差异有统计学意义(P<0.05,t检验,n=6或8)。在离视神经约5625μm的导管内部,转基因雪旺细胞导管组的再生轴突数量为2.86±1.08/mm/section,而单纯雪旺细胞导管组的再生轴突数量为0.3±0.1/mm/section,两组之间差异有统计学意义(P<0.05,t检验,n=6或8)。说明移植转染CNTF的雪旺细胞填充的神经导管组的再生效果比移植单纯雪旺细胞填充的神经导管组好。(3)电镜观察再生轴突：导管移植4周后,电镜观察见导管内转基因的雪旺细胞导管内仍可见存活的雪旺细胞,并且可见再生神经纤维,从而进一步证实了轴突的再生。(4)导管内部炎症情况和导管降解情况的观察：巨噬细胞和小胶质细胞标记物OX42对导管冰冻切片的免疫组化染色显示移植4周后,导管内没有严重的炎症反应。导管在体内移植后2个月后降解。结论：我们成功研制了一种新的可降解的组织工程化神经导管,可以有效地促进成年大鼠的视神经再生.该导管的研发为将来治疗各种神经轴突损伤性疾病打下一定研究基础。第二部分：EphrinA3对成年小鼠视网膜干细胞增殖及分化作用的研究目的：探索ephrinA3在成年小鼠视网膜干细胞龛内的作用,并探讨其作用机制,为寻找新的调节视网膜干细胞增殖和分化的靶点,从而为调控视网膜干细胞增殖和分化,治疗各种视网膜神经细胞变性疾病打下基础。方法：(1)检测ephrinA3在小鼠视网膜上的表达情况：用Western blot检测不同年龄的小鼠视网膜内ephrinA3的表达趋势,并用免疫组化的方法观察在成年小鼠的视网膜ephrinA3的表达部位。(2)在体实验观察ephrinA3基因敲除鼠和野生鼠视网膜干细胞的增殖情况：用BrdU活体标记,免疫组化染色,并在荧光显微镜下计数观察成年ephrinA3基因敲除鼠和成年野生鼠体内的视网膜干细胞增殖情况。(3)体外实验观察ephrinA3对视网膜干细胞增殖的影响：离体培养ephrinA3基因敲除小鼠和野生鼠视网膜干细胞,比较其形成原代和第二代神经球的数量,另外用BrdU掺入实验比较两种视网膜干细胞的增殖能力。培养野生型视网膜干细胞,加入ephrinA3蛋白,比较加入ephrinA3蛋白组和对照组干细胞的增殖能力。(4)比较两种神经球干细胞标记物的表达情况：用Real-timePCR及RT-PCR的方法比较两种神经球的各种干细胞标记物的表达情况。(5)比较两种视网膜干细胞的分化情况：体外诱导分化视网膜干细胞,并用各种细胞标记物标染以观察其分化情况。用Real-time PCR的方法比较干细胞分化前后干细胞标记物的表达情况,以及比较ephrinA3基因敲除干细胞和野生型干细胞分化后各种视网膜细胞标记物的表达情况。(6)ephrinA3受体分子的研究：用RT-PCR检测在野生型神经球中EphA4和EphA7的表达情况,并用免疫沉淀检测野生鼠睫状体上皮组织中ephrinA3的相应受体,用免疫组化检测EphA4在成年小鼠视网膜中的表达部位,并用western blot检测ephrinA3基因敲除鼠和野生鼠睫状体上皮组织中EphA4磷酸化程度的不同,从而推测EphA4和ephrinA3之间的关系。(7)探索ephrinA3作用的下游分子通路：用Wnt3a加入培养的野生型视网膜干细胞中,通过检测BrdU掺入实验来观察Wnt3a对视网膜干细胞增殖能力的影响。用Western blot检测ephrinA3基因敲除视网膜干细胞和野生型视网膜干细胞中Wnt3a的下游通路分子β-catenin的表达及该分子的磷酸化程度,从而推测ephrinA3的下游分子通路。结果：(1) ephrinA3在小鼠视网膜上的表达情况：Western blot结果显示,ephrinA3从出生后10天开始可以在视网膜组织中检测得到,在成年期表达有所增强。在成年小鼠的视网膜,ephrinA3主要表达在视网膜的内丛状层和外丛状层,并较低地表达在睫状体上皮组织。(2)在体实验观察ephrinA3基因敲除鼠和野生鼠视网膜干细胞的增殖情况：通过BrdU活体标记后染色计数可知,成年ephrinA3基因敲除鼠睫状体边缘部的增殖细胞数量为0.0835±0.0478个／切片,明显多于成年野生型小鼠睫状体边缘部的增殖细胞数量0.00337±0.00337个／切片(P<0.05, Mann-Whitney Rank Sum Test, n=9)。而且增殖细胞可同时标染干细胞标记物Chx10,说明这些增殖细胞为视网膜的干细胞。(3)体外实验观察ephrinA3对视网膜干细胞增殖的影响：在离体培养中发现,ephrinA3基因敲除鼠组所生成的原代神经球的数量是野生型小鼠组的1.72±0.07倍(P＜0.01,t检验,n=3); ephrinA3基因敲除小鼠组生成第二代神经球的数量是野生型小鼠组的2.13±0.235倍(P<0.01,t检验,n=3); ephrinA3基因敲除小鼠组的视网膜干细胞BrdU掺入百分比(57.5%±2.4%)高于野生小鼠组(34%±5.2%)(P<0.05,t检验,n=3),说明ephrinA3基因敲除组视网膜干细胞的增殖能力高于野生小鼠的视网膜干细胞。如果在培养皿中加入ephrinA3蛋白,野生型的视网膜干细胞BrdU掺入百分比会从原来的33.8%±0.8%下降至25.6%±0.8%(P<0.05,t检验,n=3),进一步说明了ephrinA3蛋白对视网膜干细胞增殖的抑制性作用。(4)比较两种神经球干细胞标记物的表达情况：Real-time PCR结果证实,phrinA3基因敲除的视网膜干细胞的各种干细胞标记物的表达量高于野生型视网膜干细胞,尤其是Wnt家族表达上调最为明显。(5)比较两种视网膜干细胞的分化情况：分化实验中证实,视网膜干细胞可以分化为多种不同种类的视网膜细胞。Realtime PCR结果显示ephrinA3基因敲除的视网膜干细胞分化后比野生型视网膜干细胞分化后表达更高的感光细胞标记物rhodopsin和ecoverin,说明ephrinA3基因敲除鼠视网膜干细胞具有更强的分化潜能。(6) ephrinA3受体分子的研究：RT-PCR证实在视网膜干细胞内EphA4的表达远高于EphA7,免疫沉淀实验证实在睫状体上皮细胞内EphA4是ephrinA3的受体分子。免疫组化显示EphA4表达在睫状体上皮上。Western blot结果证实野生型小鼠的睫状体上皮组织的EphA4磷酸化程度高于ephrinA3基因敲除鼠的睫状体上皮组织。证实EphA4是ephrinA3在睫状体上皮细胞上的受体。(7) ephrinA3调节视网膜干细胞增殖的下游分子通路：加入Wnt3a后,视网膜干细胞的BrdU掺入百分比明显升高, Western blot结果显示在ephrinA基因敲除鼠视网膜干细胞原代神经球里β-catenin (Wnt3a的下游通道分子)和磷酸化的β-catenin的表达比野生鼠均有提高,故认为而Wnt/β-catenin分子通路可能是ephrinA3参与调节视网膜干细胞增殖的的下游通路。结论：ephrinA3是小鼠成年视网膜干细胞龛中的一种内源性抑制性分子,它可能通过视网膜干细胞上的EphA4受体,调控下游Wnt/β-catenin分子通路来抑制视网膜干细胞的增殖和分化。对ephrinA3的作用及其机制的了解,为将来调控体内视网膜干细胞增殖和分化,治疗临床疾病方面打下了一定的基础。下一步将研究敲除遗传性视网膜变性小鼠体内的ephrinA3,观察其体内视网膜干细胞是否能再生更多的视网膜神经细胞,从而起到挽救或延迟视网膜病变的作用。