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研究背景Hedgehog信号通路在胚胎发育、分化、机体内环境稳定、组织修复等生长发育和生理过程中起着重要作用。近年来发现Hedgehog信号通路在多种肿瘤组织中被异常激活,进一步研究表明Hedgehog信号通路的异常激活与肿瘤细胞的增殖分化、凋亡、血管新生以及侵袭转移等密切相关。Hedgehog信号通路的组成主要包括以下几个部分:Hedgehog（Hh）配体,Patched（Ptch）蛋白,smoothened（SMO）蛋白,glioma associated oncogene homolog（Gli）转录因子及其下游靶基因。SMO蛋白作为Hedgehog信号通路的中间转导靶点,在其下游存在一个庞大的传递Hh信号的胞内多分子网络,主要包括suppressor of fused（Sufu）、protein kinase A（PKA）、glycogen synthase kinase 3（GSK3）以及 dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase-1A（DYRK1）等,信号传递最终修饰Gli转录因子而调控目的基因的表达,所以SMO蛋白又被称为信号开关蛋白。Vismodegib和NVP-LDE-225是目前临床上仅有的两种靶向SMO靶点抗肿瘤药物,但SMO蛋白的突变削弱了药物与SMO蛋白之间的结合力,导致治疗效果下降和耐药的出现。因此高效、低毒性的新型SMO抑制剂的小分子化合物的研发显得尤为重要。研究目的本研究拟设计和合成一系列靶向性好、毒性小、结构全新的SMO蛋白靶向抑制剂,并在体内外评价这一系列新型SMO蛋白靶向抑制剂的生物学活性。研究方法1.设计、合成结构全新的8-氯-3-（5-氨基-2-氯苯基）-[1,2,4]三氮唑并[4,3-a]吡啶类衍生物（A1-A20）。2.Schrodinger预测化合物（A1-A20）的体内吸收、分布、代谢以及排泄（absorption、distribution、metabolism、excretion,ADME）的药代动力学性质。3.双荧光素酶报告基因实验评价化合物（A1-A20）对SMO蛋白的靶向抑制作用。4.分子对接模拟化合物A3、A14、A15以及A17与SMO蛋白的结合位点。5.表面等离子共振（surface plasmon resonance,SPR）实验评价化合物A3、A14、A15以及A17与SMO蛋白的结合力。6.荧光共聚焦显微镜观察化合物A3和A14对SMO蛋白在细胞中由细胞质向初级纤毛迁移的作用。7.MTT实验评价化合物（A1-A20）对人结肠癌细胞株（HCT-15、RKO、HCT-116、SW-620、HT-29）,人乳腺癌细胞株（MDA-MB-468、MDA-MB-23]、MCF-7、T47D）,人非小细胞肺癌细胞株（A549）,人胶质瘤细胞株（U251）以及人宫颈癌细胞株（Hela、AN3-CA）细胞增殖的作用。8.细胞克隆形成实验评价化合物A14对肿瘤细胞克隆形成的作用。9.流式细胞术评价化合物A14对肿瘤细胞株HCT-15、RKO、HCT-116、SW-620以及HT-29细胞周期和凋亡的影响。Western-blot检测细胞周期和细胞凋亡相关蛋白的变化。10.细胞划痕实验评价化合物A14对肿瘤细胞迁移能力的作用。11.Western-blot评价化合物A14对肿瘤细胞中Hedgehog信号通路上主要蛋白表达的作用。12.荧光共聚焦显微镜观察化合物A14对肿瘤细胞株HT-29和RKO细胞中细胞质中的SMO蛋白向初级纤毛迁移的影响。13.体内实验评价化合物A14对裸鼠移植瘤（HT-29）增殖的作用。实验结果1.设计并合成了 20个新型的8-氯-3-（5-氨基-2-氯苯基）-[1,2,4]三氮唑并[4,3-a]吡啶类衍生物（A1-A20）,并通过 1H-NMR、13C-NMR 以及 HR-ESI-MS对这一系列化合物的结构进行确认。2.Schrodinger预测结果显示化合物（A1-A20）体内ADME的药代动力学性质均符合Lipinski’s规则的至少4个条件。3.双荧光素酶实验结果表明化合物（A1-A20）能够显著的靶向抑制SMO蛋白的活性进而抑制Hedgehog信号通路的激活,其中化合物A3、A14、A15以及A17对SMO蛋白的抑制作用较强,IC50值分别为101±14.7 nM,95.8±1.6 nM,93±7.3 nM 和 92.6±12.9 nM。4.分子模拟实验结果表明化合物A3、A14、A15以及A17能够通过氢键作用与SMO蛋白受体（PDB,5L7I）的配体结构域结合。5.SPR结果表明,化合物A3、A14、A15以及A17与SMO蛋白之间的平衡解离常数（Equilibrium dissociation constant,KD）分别为 1.21×10-5 mol/L、1.36×10-5 mol/L、1.03×10-8mol/L 以及 1.06×10-8 mol/L。6.荧光共聚焦实验结果表明,代表性化合物A3和A14可以阻断细胞质中的SMO蛋白向初级纤毛的迁移。7.MTT实验结果表明,化合物（A1-A20）能够抑制HCT-15、RKO、HCT-116、SW-620、HT-29、MDA-MB-468、MDA-MB-231、MCF-7、T47D、A549、U251、Hela以及AN3-CA等肿瘤细胞的增殖,IC50值在6.2±1.5μM～96.4±11.2 μM之间。8.细胞克隆形成实验结果表明,化合物A14能抑制HCT-15、RKO、HCT-116、SW-620以及HT-29细胞克隆的形成,IC50值分别为12.05 ± 2.35μM、3.53±0.34μM、18.20±3.80 μM、11.65±0.29 μM以及 11.75±0.35μM。9.细胞周期实验结果表明,化合物A14能诱导HCT-15、RKO、HCT-116、SW-620以及HT-29细胞在细胞周期G0/G1产生阻滞,同时可诱导细胞凋亡,作用均呈时间依赖性。Western-blot结果显示,化合物A14诱导蛋白p53、p21的表达上调;诱导p-AKT、p-Erk1/2表达下调;除HCT-116外,其余四株肿瘤细胞中Bax蛋白的表达下调;在RKO和HT-29细胞中抑制E2F1的表达。10.细胞划痕结果可见,化合物A14能抑制HT-29和RKO细胞划痕面积的愈合。11.Western-blot检测Hedgehog信号通路中上下游蛋白Gli1、Shh、Ptch2和SMO蛋白表达的结果表明,化合物A14处理72 h后,HCT-15、HCT-116和HT-29细胞中的Gli1表达均下调;HT-29细胞中Shh表达下调,五种细胞中Ptch2和SMO的表达均无明显变化。12.荧光共聚焦实验结果表明,化合物A14可以阻断敏感细胞株HT-29和RKO细胞质中的SMO蛋白向初级纤毛的迁移。13.-体内实验结果表明,化合物A14无明显毒性,对裸鼠移植瘤增殖的抑制作用呈浓度梯度依赖。结论我们设计并合成的20个结构全新的8-氯-3-（5-氨基-2-氯苯基）-[1,2,4]三氮唑并[4,3-a]吡啶类衍生物（A1-A20）能够靶向抑制SMO蛋白的活性。化合物能-够很好的进入SMO蛋白配体结构域并通过氢键作用与SMO蛋白结合;结合的平衡解离常数小于10-5 mol/L。化合物不影响SMO蛋白的表达,主要通过阻断细胞质中的SMO蛋白向初级纤毛迁移而抑制SMO蛋白的活性。SMO蛋白作为与肿瘤发生与形成密切相关的Hedgehog信号通路的信号开关蛋白,化合物（A1-A20）通过抑制SMO蛋白的活性而产生明显和广泛的抗肿瘤效果,对人体正常细胞的细胞毒性较低。其中化合物A14抗结肠癌的效果最强,能够明显的将结肠癌细胞的细胞周期阻滞在G0/G1期,诱导细胞产生凋亡,并抑制细胞的迁移能力;在裸鼠体内,无明显毒性,对裸鼠移植瘤增殖的抑制作用呈浓度梯度依赖性。