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[研究背景]:种植体周围炎（implantitis）是影响种植修复效果的重要因素,众多学者都对其发生的病因和影响因素进行了研究探讨。包括全身因素、吸烟习惯、菌斑微生物、粘结剂残留等局部因素在内的各种影响因素都已经被人们广泛讨论。钛材料虽然有着很好的生物相容性,但是由于机械磨耗、化学腐蚀等作用,尤其是在口腔的低氧低PH值环境中,同样会出现腐蚀磨耗。研究发现,种植体周围的软硬组织中有钛磨损产物的存在。钛磨损颗粒（titanium wear particle）是常见的钛磨损产物,在种植体周围炎病例的组织中常可检出。钛磨损颗粒会引起局部组织的免疫反应,导致炎性因子分泌增加,进而引起组织损伤。但是国内外对钛磨损产物对种植体周围软组织影响的相关报道比较少。种植体体周围炎常常从种植体周围黏膜炎开始。种植体周围软组织与自然牙周围的组织有很大不同,种植体-软组织界面形成的袖口的生物学屏障功能对保护种植体周围组织稳定有重要意义。如果该结构遭到破坏,会严重影响其下面种植体周围骨组织的稳定。在软组织中,牙銀成纤维细胞（human gingival fibroblast,HGF）所占比例最大,既能够提供阻挡外界刺激的机械屏障,又能够通过免疫反应保护组织结构,因此对维持软组织的健康有重要作用。牙龈成纤维细胞在种植体表面的粘附、迁移和增殖等生物学行为的正常进行,是其发挥防御能力的前提,因此研究钛磨损颗粒对牙龈成纤维细胞生物学行为的影响有重要意义。同时,在口腔环境中的种植体周围不可避免的有细菌脂多糖内毒素（Lipopolysaccharides,LPS）的存在,而钛颗粒与LPS的相互做用关系仍不清楚。因此,钛磨损颗粒与LPS的相互作用及其对牙龈成纤维细胞免疫反应的影响是非常值得探讨的问题。由于种植体钛表面的二氧化钛涂层容易在机械摩擦和化学作用下剥脱,因此本课题使用了具有代表性的二氧化钛纳米颗粒（titanium dioxide nanoparticles,TiO2NPs）和二氧化钛微米颗粒（titanium dioxide microparticles,TiO2MPs）两种二氧化钛颗粒产物进行研究。在体外探讨TiO2 NPs和TiO2 MPs对HGF细胞生物学行为和炎症反应的影响能够揭示钛磨损产物在种植体周围炎和黏膜炎发生发展中扮演的角色。此外,我们研究了咖啡酸苯乙酯（caffeic acid phenethyl ester,CAPE）在抑制LPS诱导的HGF细胞炎症反应中的作用机制,并将其用于TiO2 NPs和TiO2 MPs诱导的HGF细胞的炎症反应中,探讨其治疗钛磨损产物所导致的种植体周围软组织炎症的潜力和作用机制。[研究目的]:探讨二氧化钛纳米和微米颗粒（TiO2 NPs和TiO2 MPs）对HGF细胞生物学行为和免疫反应的影响及作用途径,探讨TiO2 NPs和TiO2 MPs与P.g-LPS在炎症反应中的相互影响关系,探讨CAPE抑制P.g-LPS诱导HGF细胞炎症反应的作用机制以及抑制TiO2 NPs和TiO2 MPs对HGF细胞影响的效果。[研究内容]:本研究的实验内容分为以下三个部分:第一部分TiO2 NPs和TiO2 MPs对HGF细胞骨架结构、粘附、迁移和增殖能力的影响1.材料与方法（1）反复贴壁法原代培养HGF细胞,形态学鉴定和抗波形丝蛋白表达鉴定细胞来源。（2）TiO2 NPs和TiO2 MPs购自Sigma公司。用反复强酸浸泡法去除颗粒中携带的内毒素。用多巴胺修饰颗粒表面,使用罗丹明B标记TiO2 NPs和TiO2 MPs。（3）0.1 mg/mlTiO2 NPs或TiO2 MPs与HGF共培养24h,激光共聚焦显微镜观察HGF细胞对颗粒的吞入情况和F-actin、vinculin、vimentin表达情况。（4）不同浓度TiO2 NPs和TiO2 MPs与HGF细胞共培养24h,CCK-8法检测细胞活性。1天、3天、7天时检测细胞增殖能力。（5）HGF接种于6孔板中,当细胞在孔板底部铺展成单层膜结构时,将TiO2 NPs或TiO2 MPs与LPS联合干预细胞。进行划痕实验检测HGF细胞迁移能力,分别于12h和24h时普通显微镜下观察HGF细胞愈合情况并拍照。（6）TiO2 NPs和TiO2 MPs单独与LPS 一起与HGF细胞共培养8小时后,将HGF细胞消化接种在Transwell小室,梯度浓度血清DMEM培养基培养24小时后,普通显微镜下计算HGF细胞穿过滤膜数量并拍照。（7）Western blot检测HGF细胞FAK、p-FAK、paxillin、p-paxillin表达情况。2.结果（1）HGF细胞贴壁生长,为长梭形或星形,呈放射状或旋涡状。抗波形丝蛋白反应阳性。（2）罗丹明B标记的TiO2 NPs和TiO2 MPs在激光共聚焦扫描显微镜下发红色荧光。（3）激光共聚焦扫描显微镜下观察到HGF细胞吞入TiO2NPs和TiO2 MPs。F-actin、vinculin、vimentin受到TiO2 NPs和TiO2 MPs不同程度的干扰发生重排和紊乱,当有P.g-LPS存在时,这种干扰更加严重。（4）高于 0.25mg/ml 的 TiO2 MPs 和高于 0.5mg/ml 的 TiO2 NPs 会使 HGF 细胞活性下降。TiO2MPs 组,LPS 组,TiO2NPs+LPS 组和 TiO2MPs+LPS 在第 3 天和第7天时,显著影响HGF细胞增值能力。（5）TiO2NPs不会影响HGF的迁移能力,TiO2 MPs会抑制HGF的迁移能力。P.g-LPS能够加重这些抑制作用。（6）TiO2 MPs组HGF细胞迁移数量显著低于TiO2NPs组。LPS组的HGF细胞迁移数量明显低于无LPS组。（7）TiO2 MPs组和+LPS组的p-FAK和p-paxillin表达显著减少,说明HGF细胞粘附能力被抑制。3.结论（1）高浓度的TiO2 NPs和TiO2 MPs对HGF细胞活性和增殖有明显的抑制作用。（2）TiO2 NPs和TiO2 MPs能够被HGF细胞内吞,内化后会通过影响HGF细胞骨架结构,引起细胞粘附、迁移增殖能力下降。但是TiO2 NPs的影响要小于TiO2 MPs的影响。（3）P.g-LPS能够显著增强TiO2 NPs和TiO2 MPs对HGF细胞的负面作用。这说明P.g-LPS的存在降低了 HGF细胞对钛磨损颗粒的抵抗能力。第二部分TiO2 NPs和TiO2 MPs联合LPS对HGF细胞炎性因子表达的影响1.材料与方法（1）1 μg/ml P.g-LPS 预处理 HGF 细胞 8h 后,与 TiO2 NPs 或 TiO2 MPs 共培养24h,收集细胞,送ICP-MS检测钛元素浓度。（2）将 lmg/ml TiO2 NPs 或 TiO2 MPs 预处理 HGF 细胞 12h 后,再与 P.g-LPS 共培养24小时,取上清液ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-1β浓度,提取细胞总RNA,RT-PCR法检测相关mRNA表达。（3）将 lmg/ml TiO2 NPs 或 TiO2 MPs 预处理 HGF 细胞 12h 后,再与 P.g-LPS 共培养30min,提取细胞总蛋白。western blot法检测TLR4,p65表达情况。2.结果（1）经过P.g-LPS预处理的HGF细胞中钛元素含量显著增加。（2）TiO2 NPs引起HGF细胞TNF-α表达上调,TiO2 MPs引起HGF细胞TNF-α、IL-1β表达上调。IL-6的分泌则没有明显变化。TiO2NPs预处理HGF细胞在P.g-LPS诱导下TNF-α、IL-6、IL-1β表达增加,而TiO2MPs预处理的HGF细胞在P.g-LPS诱导下TNF-α、IL-6、IL-1β表达降低。（3）单独TiO2NPs的处理,HGF细胞表达TLR4和磷酸化p65都有所增加,但是增加没有LPS组明显。但是,当HGF细胞经过TiO2 NPs预处理后,在P.g-LPS的诱导下,TLR4活化明显增强,磷酸化p65表达显著增加。（4）在TiO2 MPs单独处理实验组中,HGF细胞TLR4和磷酸化p65的表达都显著增强。但是,在TiO2MPs预处理HGF细胞的实验组中,HGF细胞在LPS诱导下,TLR4和磷酸化p65的表达情况均显著下降,高于单纯TiO2 MPs干预组,低于 TiO2MPs+LPS 组。3.结论（1）P.g-LPS可以增加HGF细胞对TiO2 NPs和TiO2 MPs的内化作用。（2）TiO2 NPs通过TLR4/NF-KB通路诱导HGF细胞TNF-α表达增加,并且加剧了 P.g-LPS引起的TNF-α,IL-6和IL-1β的产生。（3）TiO2 MPs通过TLR4/NF-κB通路诱导HGF细胞TNF-α和IL-1β表达增加,且其作用强于TiO2 NPs。TiO2 MPs对HGF细胞的干预使HGF细胞对P.g-LPS产生耐受,导致P.g-LPS诱导的TNF-α,IL-6和IL-1β的分泌降低。第三部分CAPE抑制HGF细胞炎性因子表达的作用机制研究1.材与方法（1）CCK-8法检测不同浓度CAPE对HGF细胞活性的影响。（2）ELISA和法检测CAPE对LPS诱导HGF细胞IL-6、IL-8表达的抑制作用,Western blot检测COX-2、iNOS蛋白表达情况。（3）Western blot检测CAPE对HGF细细胞TLR4、、NF-κB、PI3K/AKT、MAPK通路活化的影响以及p65的核内转移情况.免疫荧光检测P65的核内表达。P65核转移试剂盒检测p65与核内DNA结合情况。（4）HGF 细胞经 CAPE 预处理 1 h 后,与 TiO2 NPs 或 TiO2 MPs 共培养 24h,ICP-MS检测HGF细胞内钛元素含量的变化。（5）ELISA 和 RT-PCR 检测 CAPE 对 TiO2 NPs 和 TiO2 MPs 诱导 HGF 细胞 TNF-α,IL-6和IL-1β表达的影响.（6）Western blot 检测 CAPE 在 TiO2 NPs 和 TiO2 MPs 对 HGF 细胞 TLR4、NF-κBp65活化中的影响情况2.结果（1）低于40μM浓度的CAPE不会显著降低HGF细胞活性。（2）CAPE显著抑制LPS诱导的HGF细胞IL-6、IL-8、COX-2、iiNOS的表达,并且呈现计量依赖性。（3）CAPE抑制LPS诱导HGF细胞TLR4、NF-κB、PI3K/AKT通路的活化,而不是MAPK通路。（4）CAPE不会改变HGF细胞摄取TiO2 NPs和TiO2 MPs。（5）CAPE 显著抑制 TiO2 NPs 和 TiO2 MPs 诱导的 HGF 细胞 TNF-α,IL-6 和 IL-1 β表达。（6）CAPE 显著抑制 TiO2 NPs 和 TiO2 MPs 诱导的 HGF 细胞 TLR4、NF-κB 活化。3.结论（1）CAPE能够抑制LPS所引起的HGF细胞IL-6,IL-8,iNOS和COX-2等炎性因子的表达,并且其作用呈剂量依赖性。（2）CAPE的抗炎机制是通过抑制TLR4介导的NF-κB通路和PI3K/AkT通路来实现的,而不是MAPK通路。（3）CAPE能够通过TLR4/NF-κB通路抑制TiO2 NPs或TiO2 MPs诱发的HGF细胞的炎症反应,但是对HGF细胞摄取TiO2 NPs或TiO2 MPs的作用没有影响。（4）CAPE在防治牙周和种植体周围软组织炎症性疾病中,有巨大潜力。