研究背景钙化性主动脉瓣疾病是老年人常见的心血管疾病。在发达国家,三分之一的60岁以上老年人行心脏超声或放射线检查提示有主动脉瓣钙化的证据,其中10%的人诊断为钙化性主动脉瓣疾病。在我国研究发现45岁以上患者钙化性主动脉瓣疾病总体患病率为12.8%。随着全球人口的增长和老龄化的趋势,钙化性主动脉瓣疾病将会越来越多。目前没有明确的药物可以延缓和阻止主动脉瓣钙化的进展,重度主动脉瓣狭窄只能行外科手术或经皮介入手术进行换瓣治疗。患者一旦发展为重度主动脉瓣狭窄,出现症状后生存时间明显缩短,威胁患者生命,给家庭和社会带来沉重的医疗负担。目前主动脉瓣钙化的病理生理机制尚不明确,需要全面和深入的研究来揭示其发生发展的机制。传统观念认为主动脉瓣钙化是与年龄老化相关的退行性改变,但是越来越多的研究证实主动脉瓣钙化的发生发展是积极主动并受严密调控的病理生理过程,包括炎症,脂质聚集,基质重构以及骨化钙化等多种分子机制。大量的研究证实炎症在主动脉瓣钙化过程中起重要作用,表明钙化性主动脉瓣疾病是一种慢性炎症疾病。已有研究发现某些引起口腔感染的细菌物质存在于钙化病变瓣膜上,而且在实验兔子体内接种这种细菌可以诱导出主动脉瓣病变,提示感染炎症可能是主动脉瓣钙化的重要机制。除了细菌感染外,还有常见的病毒感染,在动脉粥样硬化的研究中发现很多病毒感染如疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒等可促进动脉粥样硬化的发生。钙化性主动脉瓣疾病与动脉粥样硬化在病理变化和发病机制方面有些相似,但是目前关于病毒感染与主动脉瓣钙化病变的相关研究很少。病毒在复制过程中可产生双链核糖核酸(dsRNA)即外源性dsRNA,它能被体内的模式识别受体识别,激活免疫细胞,诱导免疫炎症反应,发挥抗病毒作用。细胞的基因在复制和转录过程中也可以产生核酸分子,在细胞破坏或死亡时释放产生的dsRNA称为内源性dsRNA。近来研究发现细胞外的核酸分子包括dsRNA作为内源性物质参与免疫炎症反应,与心肌缺血再灌注损伤、肾功能衰竭、糖尿病、自身免疫性疾病和神经系统退行性疾病密切相关。目前外源性或内源性核酸分子dsRNA在主动脉瓣钙化病变发生发展过程中的作用尚未可知。病毒性dsRNA和内源性dsRNA均主要由Toll样受体3(TLR3)来识别。Toll样受体(TLRs)是一类识别病原相关分子模式和损伤相关分子模式的重要受体家族,在宿主防御外来微生物危害和组织损伤方面起重要作用。TLR3分布在免疫细胞和非免疫细胞的细胞膜或内涵体膜上,TLR3识别外源性或内源性dsRNA后,募集转接分子β干扰素TIR结构域连接蛋白(TRIF),进而激活下游的干扰素调节因子3(IRF3)、核转录因子κB(NF-1κB)以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)等信号通路,将信号传导至细胞核内促进相关基因转录和蛋白质表达,参与人体生理功能及疾病的病理生理过程。主动脉瓣膜间质细胞是主动脉瓣的主要细胞成分,在钙化性主动脉瓣狭窄的发生发展过程中起重要作用。致动脉粥样硬化因子和机械力可以刺激主动脉瓣膜间质细胞表达细胞因子,生长因子,基质蛋白和骨化介质。我们既往的研究发现刺激主动脉瓣膜间质细胞上的TLR2/4能产生炎症反应并使间质细胞转变为成骨细胞表型。但是TLR3及其配基dsRNA对人主动脉瓣膜间质细胞的影响及作用机制尚不清楚。聚肌苷酸-聚胞啶酸[poly(I:C)]是dsRNA的类似物,广泛用于体内体外研究,一些研究发现poly(I:C)能刺激炎症细胞活化产生细胞因子,能刺激间充质干细胞向成骨细胞分化。因此本研究选用了 poly(I:C)作为dsRNA类似物刺激人主动脉瓣膜间质细胞,观察炎症介质和骨化因子在间质细胞的表达,以及细胞内钙沉积和钙结节的形成,并探讨了其中可能的分子信号机制,为钙化性主动脉瓣疾病的潜在防治靶点提供理论依据。目的本研究的目的是探讨dsRNA和TLR3诱导人主动脉瓣膜间质细胞炎症、骨化反应,促进钙结节形成,以及这些作用发生的可能分子信号机制。方法1.从正常的人主动脉瓣膜组织中分离出瓣膜间质细胞进行培养,细胞传代至4-6代用于研究。将细胞传代至6孔或24孔细胞培养板以及玻片上,等长至覆盖培养孔80%-90%时处理细胞。2.Poly(I:C)处理细胞2小时至24小时,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定细胞培养上清液中单核细胞趋化因子(MCP-1)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)和白介素-1β(IL-1β)的浓度;应用免疫印迹方法(western immunoblotting)测定细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、骨成型蛋白-2(BMP-2)、碱性磷酸酶(ALp)和转化生长因子-β1(TGF-β1)蛋白表达量。3.延长poly(I:C)处理细胞时间至2周,应用ALP活性染色检测细胞ALP的活性,应用茜素红S(Alizarin redS)染色,检测细胞钙沉积。4.Poly(I：C)处理细胞30分钟至24小时,应用免疫印迹方法测定NF-κB p65和ERK1/2磷酸化水平。5.应用基因沉默的方法,予TLR3 siRNA或TRIF siRNA预处理细胞72小时。Poly(I:C)处理细胞24小时,应用酶联免疫吸附试验测定MCP-1、IL-6和IL-8浓度;应用免疫印迹方法分析TLR3、TRIF、ICAM-1、BMP-2、ALP和TGF-β1蛋白表达量。Poly(I:C)处理细胞2小时至8小时,分析NF-κBp65、ERK1/2磷酸化水平的变化。6.应用 IKK 抑制剂(Bay11-7082)或 ERK1/2 抑制剂(328000ERK)处理细胞1小时后,再予poly(I:C)处理细胞24小时,应用酶联免疫吸附试验测定MCP-1、IL-6和IL-8浓度;应用免疫印迹方法分析ICAM-1、BMP-2、ALP和TGF-β1蛋白表达量。7.应用NF-κB p50迁移抑制剂SN50预处理细胞1小时。Poly(I:C)处理细胞24小时,应用酶联免疫吸附试验测定MCP-1、IL-6和IL-8浓度;应用免疫印迹方法分析ICAM-1蛋白表达量。内毒素(LPS)处理细胞24小时,应用免疫印迹方法分析ICAM-1蛋白表达量。8.Poly(I:C)或LPS处理细胞30分钟到24小时,应用免疫印迹方法测定NF-κB p50蛋白表达。Poly(I:C)或LPS分别处理细胞1小时和2小时,应用免疫共沉淀方法测定NF-κB p65/p50异二聚体表达。9.SN50预处理细胞1小时,再予poly(I：C)或LPS处理细胞1小时和2小时,应用免疫荧光染色的方法检测p50和p65亚基在细胞核内聚集情况。结果1.Poly(I:C)(0.5-10μg/mL)能刺激人主动脉瓣膜间质细胞表达ICAM-1、BMP-2、ALP和TGF-β1增多,并呈剂量反应性。2.5μg/mLpoly(I:C)诱导瓣膜间质细胞表达ICAM-1、BMP-2、TGF-β1和ALP蛋白分别增加约11倍、2.4倍、2.1倍和1.8倍,与未处理对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。Poly(I:C)能刺激间质细胞分泌MCP-1、IL-6和IL-8明显增多:IL-6(134.279±19.661pg/mL VS 668.317±71.411 pg/mL),IL-8(10.198士6.363 pg/mL VS 1345.647±339.309 pg/mL),MCP-1(254.893士58.556 pg/mL VS 782.355±123.391pg/mL),与未处理对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。2.Poly(I：C)处理后IL-1β浓度无明显增加,与未处理的对照组相比,差异没有统计学意义(P>0.05),而且poly(I:C)刺激后细胞培养上清中的IL-1β浓度很低,低于 31pg/mL。3.人主动脉瓣膜间质细胞给予poly(I:C)处理2周后细胞ALP活性明显增加,细胞钙沉积增多并形成钙结节。半定量钙染色结果显示poly(I:C)刺激使钙沉积与未处理对照组比较增加约4.5倍,差异有统计学意义(P<0.05)。4.Poly(I:C)能快速和较持久的刺激NF-κBp65、ERK1/2磷酸化。poly(I：C)刺激后,NF-κB p65磷酸化在1小时开始增加,2小时达到高峰,4小时后仍存在,与未处理对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05);ERK1/2磷酸化在30分钟就开始增加,2小时达到高峰,8小时仍明显活化,与未处理对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。5.应用基因沉默的方法能明显降低TLR3和TRIF蛋白表达,TLR3 siRNA降低TLR3蛋白表达量约60%,TRIF siRNA使TRIF蛋白表达几乎完全抑制,siRNA处理组与未处理对照组、单用poly(I:C)组、poly(I:C)+scrambled siRNA组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。阻断TLR3作用后,poly(I:C)刺激NF-κB p65和ERK1/2磷酸化作用明显减弱,与单用poly(I:C)组比降低了约2倍,差异有统计学意义(P<0.05),与未处理对照组比差异无统计学意义(P>0.05)。阻断TRIF作用后,poly(I:C)刺激NF-κB p65和ERK1/2磷酸化作用显著减弱,与单用poly(I:C)组比降低了约4倍,差异有统计学意义(P<0.05),与未处理对照组比差异无统计学意义(P>0.05)。阻断TLR3和TRIF后,poly(I:C)刺激ICAM-1、BMP-2、ALP和TGF-β1表达以及MCP-1、IL-6和IL-8分泌的作用被明显阻断,与单用poly(I:C)组比较差异有统计学意义(P<0.05)。ICAM-1、BMP-2、ALP、TGF-β1表达量和IL-6、MCP-1浓度与未处理对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。阻断TLR3后IL-8浓度仍高于未处理对照组,差异有统计学意义(489.453±65.207 pg/mL VS 148.021±52.088 pg/mL,P=0.024),阻断 TRIF 后 IL-8浓度与未处理对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。6.IKK 抑制剂 Bay11-7082 能显著抑制 poly(I:C)刺激的 ICAM-1、BMP-2、ALP 和 TGF-β1 表达及 MCP-1、IL-6 和 IL-8 分泌。ICAM-1、BMP-2、ALP、TGF-β1表达量和MCP-1、IL-6和IL-8浓度显著降低,与单用poly(I:C)组比较差异有统计学意义(P<0.05),与未处理对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。7.ERK1/2 抑制剂 328000ERK 不能抑制 poly(I:C)刺激的 ICAM-1、MCP-1、IL-6和IL-8炎症因子表达,ICAM-1表达量及MCP-1、IL-6和IL-8浓度与单用poly(I:C)组比较差异无统计学意义(P>0.05)。ERK1/2抑制剂能明显抑制poly(I:C)刺激的BMP-2、ALP和TGF-β1骨化因子表达,BMP-2、ALP和TGF-β1蛋白表达量明显降低,与单用poly(I:C)组比较差异有统计学意义(P<0.05),与未处理对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。8.NF-κB p50迁移抑制剂SN50不能抑制poly(I:C)刺激的ICAM-1、MCP-1、IL-6和IL-8表达,IL-6和IL-8浓度轻度升高,与单用poly(I:C)组比较差异没有统计学意义(P>0.05)。ICAM-1表达反而增加1.7倍,MCP-1浓度也明显增加:(1702.690±135.736pg/mLVS 1226.033±76.326pg/mL),与单用 poly(I:C)比较差异有统计学意义(P<0.05)。SN50明显抑制LPS刺激的ICAM-1表达,ICAM-1表达量显著降低,与单用LPS比较差异有统计学意义(P<0.05),与未处理对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。9.NF-κB p50亚基和p65/p50异二聚体在人主动脉瓣间质细胞表达明显,poly(I:C)处理与LPS处理比较,两者间无明显差异。免疫荧光染色显示poly(I:C)或LPS刺激间质细胞1小时和2小时后,NF-κB p50和p65亚基明显在细胞核内聚集,SN50能明显抑制poly(I:C)或LPS诱导的p50亚基在细胞核内聚集,能明显抑制LPS诱导的p65亚基核内聚集,但不能抑制poly(I:C)诱导的p65亚基核内聚集。结论1.双链核糖核酸刺激人主动脉瓣膜间质细胞表达和分泌炎症介质:细胞间黏附分子-1、白介素-6、白介素-8、单核细胞趋化因子-1和骨化因子:骨形成蛋白-2、碱性磷酸酶和转化生长因子-β1。较长时间的刺激能增加瓣膜间质细胞碱性磷酸酶的活性,促进钙沉积并形成钙结节。2.双链核糖核酸刺激人主动脉瓣膜间质细胞炎症反应的作用由TLR3-TRIF-NF-KB信号通路介导,刺激瓣膜间质细胞骨化反应的作用由TLR3-TRIF-NF-KB 和 ERK1/2 信号通路介导。3.双链核糖核酸不能激活人主动脉瓣膜间质细胞NLRP3炎症体。4.Toll样受体3激活的核因子κB复合物不是经典的p65/p50异二聚体复合物。在本研究中我们揭示了 dsRNA激活TLR3能诱导人主动脉瓣膜间质细胞产生多种炎症因子和骨化介质,形成钙结节,并探讨了这些作用的分子机制,提示TLR3介导人主动脉瓣膜间质细胞炎症和骨化反应参与钙化性主动脉瓣膜病变的发生发展。深入认识TLR3这一内在免疫受体在瓣膜钙化病变中的作用机制,可能有助于钙化性主动脉瓣疾病药物治疗的研究进展。