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前言肾小球硬化是各种肾小球疾病进展的共同结局,其重要物质基础是肾小球内细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的大量沉积。研究表明：转化生长因子-β1(TGF-β1)可以促进肾小球系膜细胞(MC)合成ECM,影响基质降解酶及其抑制剂的合成、分泌及整合素的表达,是肾小球硬化的重要影响因子。饰胶蛋白聚糖(decorin,DCN)是一种富含亮氨酸的小分子蛋白聚糖,在ECM合成、组成和细胞生长调控等方面发挥重要作用。研究证实：DCN可以中和TGF-β1的活性,被认为是TGF-β1的负反馈调节因子。我们的前期研究也发现：DCN的过表达不仅抑制MC系膜细胞TGF-β1Col IV的表达,而且参与调控MC的生长和凋亡。因此DCN是一个很有应用前景的防治肾小球疾病的细胞因子。基因治疗作为一种有潜力的疾病治疗手段,越来越多的被研究工作者所关注。聚乙烯亚胺是(PEI)一种阳离子有机聚合物,为研究应用最广的非病毒基因载体之一。PEI是一种高水溶性有机聚合物,它每隔2个碳原子就有一个氮原子,在生理条件下,大约20%的氮原子发生质子化,因此表面带有大量正电荷,可以通过静电作用和带负电的质粒DNA (pDNA)结合,并且能压缩、包裹质粒形成稳定的纳米复合物。PEI作为基因载体具有较高的转染效率,较低的毒性,无免疫原性,易于修饰等优点,已经成功的被运用到体内体外的许多实验。本课题利用静电作用合成PEI/pDCN纳米复合物,体外转染MC,经(3418筛选,挑选出稳定高表达DCN蛋白的稳转克隆,并利用MC回输肾脏后可定居于肾小球系膜区的特性,把稳转克隆经左肾动脉回输到大鼠Thy-1肾炎动物模型肾内,观察分泌的DCN对肾小球MC增生和ECM沉积的抑制作用。同时,细胞学实验也验证了DCN的过表达对TGF-β1和Col Ⅳ的拮抗作用,和对MC生长的调控。通过本课题的研究,为肾小球疾病的纳米基因治疗提供新的实验依据。第一部分PEI/pDCN纳米复合物的合成、转染及对大鼠肾MC生长的影响目的合成PEI/pDCN纳米复合物,体外稳定转染MC并探讨DCN过表达对大鼠MC的影响。方法混合带正电荷的PEI和带负电荷的质粒,通过自发的静电作用可以形成稳定的纳米复合物子；由于不同的N/P比值会影响到纳米复合物的转染效率,所以先以EGFP质粒为报告基因,体外转染MC,选出最佳的N/P比值,以此比值再合成PEI/pDCN纳米复合物,转染MC,用G418筛选阳性细胞克隆,用Western blot方法检测,选出DCN高表达的稳转细胞克隆,进行细胞学实验及后续的动物实验；用Western blot方法,检测DCN过表达对系膜细胞IV型胶原和TGF-β1的蛋白表达；应用流式细胞仪检测细胞周期。结果用NicompTM380粒径分析仪测定合成的PEI/pDCN纳米复合物粒径在146±70.91nm到151.7±72.43nm之间；不同的N：P比例合成的PEI/pEGFP纳米复合物转染MC,在N/P比值为20：1的条件下转染效率最高,和商品化的脂质体转染试剂的转染效率相近；以此比例合成PEI/pDCN纳米复合物,转染MC,经G418筛选、Western blot鉴定,选出稳定表达DCN的稳转克隆D6；稳定转染pcDNA3.1A-DCN质粒可上调MC内DCN蛋白表达,降低Col IV和TGF-β1的蛋白表达水平,并且使Go/G1期的细胞数明显增多,S期的细胞数减少,提示MC生长受到抑制。小结通过自发的静电作用PEI和质粒DNA合成纳米复合物,可以在体外转染MC,并且能获得稳定高表达DCN基因的MC株(D6)。DCN参与调控MC的生长,且可有效调节MC内TGF-β1和Col IV的蛋白表达。第二部分肾动脉回输PEI/pDCN纳米复合物稳定转染的MC对大鼠Thy-1肾炎的治疗作用目的明确回输稳定表达DCN的MC对大鼠Thy-1肾炎的治疗作用方法提取大鼠胸腺细胞免疫兔子制备ATS,免疫荧光法检测其效价；通过SD大鼠的尾静脉注射复制大鼠Thy-1肾炎模型；建立PEI/pEGFP内米复合物稳定转染MC,然后通过左肾动脉回输稳转细胞,进而明确回输细胞在大鼠肾脏内的定位；经左肾动脉回输稳转细胞克隆D6到Thy-1肾炎模型鼠的左侧肾脏,然后用免疫组化检测相关指标,明确回输的D6对肾小球疾病的影响。结果成功制备大鼠ATS抗血清,并成功复制大鼠Thy-1肾炎模型。回输细胞在肾小球中的定位：左肾约65±2.13%肾小球成阳性表达,回输细胞主要定位于肾小球毛细血管和肾系膜区。回输D6稳转细胞能在肾小球内表达DCN蛋白,在回输第3天,DCN的蛋白表达量最高。在大鼠Thy-1肾炎模型中,回输稳定表达DNC蛋白的D6克隆,可影响肾小球病变,降低Col IV和PCNA的表达。小结通过制备ATS抗血清,成功复制大鼠Thy-1肾炎模型；经左肾动脉成功回输稳转MC到大鼠肾脏,并明确其定位于肾小球；回输的D6稳转细胞能在肾小球内表达DCN蛋白；在大鼠Thy-1肾炎模型中,与对侧肾相比较,回输肾的肾小球病变,包括PCNA和Col IV的表达均有不同程度的降低。