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母禽输卵管存在一种特殊的管状腺,因其具有贮存精子的功能,故称贮精腺,贮精腺的微环境有利于精子保存,因此自然交配或人工授精后精子在此可长时间存活并保持受精能力。Neurexophilin1(nxph1)是贮精腺中存在的差异表达基因,因此本论文研究NXPH1蛋白在鸡生殖道内的表达,用毕赤酵母表达nxph1基因,并研究该真核表达产物对鸡成纤维细胞培养液环境和精子穿孔数的影响。 采用免疫组织化学方法研究产蛋期母鸡和性成熟公鸡生殖道内NXPH1的分布,发现NXPH1仅在公鸡附睾近端输出管表达,NXPH1在整个母鸡输卵管的漏斗部、膨大部、峡部、子宫部、子宫阴道交接部表达,且在漏斗部表达的阳性信号最强。 根据鸡nxph1的序列,结合毕赤酵母密码子的偏好性,合成nxph1基因,设计引物以合成基因为模板,扩增其去除信号肽的DNA序列,将合成的nxph1基因及去除信号肽的△nxph1基因分别插入pPICZαA真核表达载体,构建重组表达质粒pPICZαA/nxph1和去除信号肽的重组表达质粒pPICZαA/△nxph1,电转入毕赤酵母GS115。阳性重组质粒每隔24h添加1%浓度的甲醇诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western Blot检测目的蛋白,大小约29kD。 体外培养鸡成纤维细胞,细胞免疫荧光染色结果表明NXPH1蛋白在鸡成纤维细胞中表达,将酵母表达的NXPH1和△NXPH1蛋白加入到鸡成纤维细胞培养液中,检测细胞培养中液Ca2+、pH值、酸性磷酸酶、碳酸酐酶的变化,结果表明加入NXPH1和△NXPH1蛋白能使细胞培养液微环境中酸性磷酸酶、pH值升高,而酸性磷酸酶和pH值升高有助于精子的运动。 将含△NXPH1蛋白的精液输入母鸡阴道,收集种蛋,计数卵黄膜精子穿孔数,结果表明与空载体组相比,△NXPH1能增加精子穿孔数,即使受精蛋的比例增多。综合上述结果,可以得出NXPH1蛋白能够促进鸡精子的运动。