【摘 要】
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壳寡糖是甲壳素脱乙酰形成的壳聚糖经物理、化学或酶法水解等多种方法处理后得到的降解产物,与壳聚糖、甲壳素相比具有较为突出的优点,且在抗肿瘤、抗菌、免疫激活和保湿等各个方面都有很好的生物活性。基于壳寡糖的多功能性,对其工业化应用的研究一直是国内外研究的热点。另外,生产壳寡糖可减少甲壳素在陆地和海洋沉积物中的积累,为缓解环境压力提供了一种解决方法。近年来,制备壳寡糖的多种技术方法已被广泛的研究与应用。酶
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壳寡糖是甲壳素脱乙酰形成的壳聚糖经物理、化学或酶法水解等多种方法处理后得到的降解产物,与壳聚糖、甲壳素相比具有较为突出的优点,且在抗肿瘤、抗菌、免疫激活和保湿等各个方面都有很好的生物活性。基于壳寡糖的多功能性,对其工业化应用的研究一直是国内外研究的热点。另外,生产壳寡糖可减少甲壳素在陆地和海洋沉积物中的积累,为缓解环境压力提供了一种解决方法。近年来,制备壳寡糖的多种技术方法已被广泛的研究与应用。酶法制备安全无毒,更适合生产壳寡糖。伴随着工业生产技术的不断升级,酶的生产方式也得到了新的改进。本研究立足于从自然界中筛选可高产壳聚糖酶的菌株,在降低生产成本的同时,为工业生产壳寡糖提供理论依据与新的技术手段。本研究以胶体壳聚糖为唯一碳源对可产壳聚糖酶的野生菌株进行筛选,通过采集样品、富集培养、平板初筛、摇瓶复筛等操作,观察不同培养时间平板上菌落的生长状况,挑取透明圈较大的菌落进行分离纯化,筛选出一株野生菌株可产壳聚糖酶。对该菌株的形态、16S r DNA以及生理生化特性鉴定,确定此菌株为芽孢杆菌属（Bacillus sp）。采用单因素实验对菌株产酶工艺及培养基配方进行优化;采用离心技术对发酵液中的粗酶进行提取,并对酶学性质进行初步探究;最后采用紫外诱变方法对该菌株进行诱变处理以获取更高产的菌株,并对诱变后的菌株和出发菌株进行5 L小罐发酵性能验证。实验结果如下:（1）芽孢杆菌的遗传稳定性以及生长特性:培养温度37℃、初始p H=10.0、培养时间16～18 h。（2）芽孢杆菌的最优产酶工艺以及培养基配方:产酶时间为36 h、初始p H=9.0、产酶温度30℃、转速180 r/min、接种量4%、装液量30 m L/250 m L;A3SC蛋白胨25.0 g/L、Springer酵母粉2.0 g/L、K2HPO4 8.0 g/L、无水Mg SO4 0.5 g/L。（3）粗酶酶学性质:最优酶解时间为70 min、酶解温度为60℃、40℃保温180 min可保持75%以上的酶活性、p H=9的缓冲液中保存3 h能保持较好的稳定性与酶学活性。（4）以芽孢杆菌作为紫外诱变的出发菌株,80%致死率为最优诱变时间,确定紫外照射时间为30 s;紫外诱变处理后筛选出一株编号为0804A的菌株其酶活较出发菌株提高了31%。对0804A菌株的遗传稳定性进行研究,结果证明该菌株有良好的遗传稳定性,在前7代能保持较好的产酶活性,且连续传代对该菌株有一定的驯化作用,传至第7代时酶活达到最大值。（5）对芽孢杆菌与诱变后的菌株进行5 L小罐发酵性能验证,结果显示诱变后的菌株在发酵各个时间点的酶活均高于出发菌株,且发酵周期更短,在较短的时间内酶活能达到较高的水平,为工业大规模生产壳寡糖提供了更多的可能。
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