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背景与目的:肾细胞癌,是最常见肾实质恶性肿瘤,其起源于肾小管上皮细胞。肾癌的病因复杂,与吸烟、药物、病毒、镉等有关。其中,吸烟是已明确的肾癌的独立危险因素之一。肿瘤干细胞是肿瘤中存在的极少量具有干细胞样特性,能自我更新并能分化成不同表型的细胞,是肿瘤的起源细胞和驱动细胞。本课题通过体外细胞实验及临床样本实验研究吸烟刺激对人肾癌干细胞干性的影响,并探讨Sonic Hedgehog信号通路在其中的作用。方法:建立无血清悬浮培养体系及体外细胞吸烟处理模型。将人肾癌细胞系786-O和ACHN分别培养于普通培养液(serum-supplied medium,SSM)和无血清悬浮培养液(serum-free medium,SFM)中。采用蛋白质印迹法(Western blot)和逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)方法检测肾癌干细胞相关蛋白及RNA含量变化,运用流式细胞学检测CD133阳性细胞数的改变。接着,利用CCK-8方法筛选出效应香烟烟雾悬液(Cigarette smoke extract,CSE)浓度,继而处理肾癌干细胞。显微镜观察CSE处理后的肾癌干细胞形态学变化(大小和数目),Western blot和qRT-PCR方法检测肾癌干细胞表面分子标志物相关蛋白及RNA含量变化;免疫荧光技术探测CSE处理后肾癌干细胞形态及干性分子标志物蛋白含量的改变;Sonic Hedgehog信号通路改变采取Western blot法检测;通路特异性抑制剂Vismodegib作用于CSE处理后的肾癌干细胞,观察其形态及分子水平改变。最后利用免疫组织化学染色方法和Western blot检测吸烟肾癌患者的肾癌干细胞分子标志物和Sonic Hedgehog信号通路的改变。结果:采用无血清悬浮培养5天后,肾癌细胞由原来的长梭形贴壁性生长变成球团状悬浮生长。肾癌干细胞特异性表面标志物CD133分子阳性细胞数明显增加。使用CCK-8方法筛选出低浓度的(0.05%,0.1%)作为实验剂量。香烟悬液处理后,肾癌干细胞球数目变多且直径变大,CD133阳性细胞数明显增加,肾癌干细胞特异性分子标志物CD133、CD44、ALDHA1、Oct4和Nanog的蛋白和RNA表达水平明显上调,增殖相关蛋白PCNA和CyclinD1表达增加,CD44荧光标记的细胞表达明显增多。除此之外,低浓度CSE处理使Shh、Smo、Gli1及Gli2表达明显增加,表明低浓度CSE处理能够激活Sonic Hedgehog信号通路。Vismodegib可以有效抑制Sonic Hedgehog信号通路,具体表现在:采用Vismodegib处理后,通路相关分子表达明显下降,肾癌干细胞成球能力显著降低,特异性分子标志物表达下调。在临床样本中,有吸烟史的肾癌患者肾癌干细胞分子标志物表达明显上调,与此同时,Sonic Hedgehog信号通路表达水平明显增加。结论:无血清悬浮培养可以分离和富集肾癌干细胞,Sonic Hedgehog信号通路正向调控吸烟诱导的肾癌干细胞干性增强。这些研究结果证实了Sonic Hedgehog在吸烟引起的肾癌过程中起着重要调控作用,为肾癌的治疗和预防提供了新的思路。