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以细菌为载体重组表达异源保护性抗原是开发多价细菌载体疫苗的主要策略,可用于针对多种病原产生免疫保护作用。在细菌多价载体疫苗构建的过程中,建立一个安全有效的抗原传递系统,是实现细菌载体疫苗多重免疫保护的重要前提。在本实验室的前期工作中,已经成功构建了一株重组大肠杆菌载体疫苗,该疫苗包含一个双质粒系统,其中的一个质粒用于高效表达异源抗原,另一个质粒用于在体内条件下产生细菌裂解蛋白以实现抗原在体内有效的释放,同时通过细菌裂解作用实现了重组细菌的生物安全控制。但上述细菌载体疫苗系统中,体内释放的抗原蛋白仅能依赖宿主巨噬细胞等的天然吞噬作用进行胞内传递,而大量的表达抗原未能被转运进入胞内。为了提高抗原向宿主胞内的传递效果,我们在本研究中,对广泛来源的细胞穿膜肽(CPPs)进行了穿膜效果评价,并选出安全高效的CPPs与抗原蛋白融合表达,并应用于细菌载体疫苗的构建和评价中。本实验选取15种CPPs,首先,通过不同插入位点与报告基因egfp(增强型绿色荧光蛋白)融合,在E.coli BL21(DE3)中构建了29个表达载体,通过表达量的高低进行初筛。其次,将初筛得到的13个CPPs-EGFP融合蛋白分离纯化,在鼠源巨噬细胞和鲤鱼上皮细胞两种细胞模型上考察穿膜效果,再次筛选得到6个安全高效的CPPs。然后,将筛选得到的CPPs同迟钝爱德华氏菌保护性抗原基因flgD融合,进行融合蛋白的表达和纯化,并考察了相关融合蛋白与巨噬细胞共孵育后诱导细胞免疫因子的差异表达情况。最后,将CPPs-flgD融合基因整合到重组大肠杆菌载体系统中,构建了有穿膜肽引导的大肠杆菌重组疫苗株,并在斑马鱼模型上考察了该疫苗株的免疫保护效果,结果表明：该疫苗株BL21(pUTaAE, pETFTA)在注射免疫条件下,其相对免疫保护力超过50%。本研究首次探索了细胞穿膜肽CPPs在鱼用细菌载体疫苗中的应用,建立了新型的重组大肠杆菌载体疫苗候选株,并在动物模型上进行了免疫效力评价。本项工作为开发安全高效的多价细菌载体疫苗做出了有益的探索。