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第一部分TRPC6在TGF-β1诱导足细胞损伤中的表达及其高表达对Nephrin、Desmin表达的影响目的:体外研究瞬时受体电位阳离子通道蛋白6(transient receptor potential cation channel 6,TRPC6)在转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导的肾小球足细胞损伤中的表达变化及其高表达对足细胞nephrin、desmin表达的影响。方法:以不同浓度(0ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、12ng/ml)TGF-β1刺激足细胞,干预72小时后倒置显微镜下观察各组细胞形态学变化,MTT检测各组细胞增殖抑制率,用免疫荧光、Real-time PCR、Wstern-blot检测TRPC6的分布及m RNA和蛋白表达。再将未干预过的MPC5细胞分组,应用12ng/ml TGF-β1处理各组细胞,分别于0、24、48、72小时应用免疫荧光、Real-time PCR、Wstern-blot检测TRPC6的分布及m RNA和蛋白表达。用脂质体法将小鼠TRPC6真核表达载体p EX-3-TRPC6及对照质粒空载体p EX-3-NC转染足细胞,48小时后应用Western-blot检测转染后TRPC6蛋白水平评估转染效率;同时应用免疫荧光、real time RT-PCR及Western印迹方法检测转染后nephrin、desmin分布及表达的变化。结果:与正常对照组相比,倒置显微镜下TGF-β1干预后足细胞足突融合、回缩,当TGF-β1增加至12ng/ml时足突甚至消失。TGF-β1对足细胞增殖具有抑制作用,当TGF-β1浓度增加至12ng/ml时,作用72h对足细胞增殖抑制率接近50%。TGF-β1作用能使足细胞TRPC6表达及分布发生变化,当TGF-β1浓度为4ng/ml,干预72小时后TRPC6 m RNA和蛋白含量即升高,但差异无统计学意义,当TGF-β1浓度提高到为8、12ng/ml时TRPC6 m RNA和蛋白含量明显升高(P<0.05),并呈剂量依赖性。应用12ng/ml干预24小时,TRPC6 m RNA和蛋白含量即升高,但差异无统计学意义,当干预时间延长至48h、72h时TRPC6 m RNA和蛋白含量明显升高(P<0.05),并呈时间依赖性。p EX-3-TRPC6转染48小时后足细胞TRPC6蛋白表达水平明显增高(P<0.05),nephrin分布未发生变化,但表达量在m RNA及蛋白水平分别下降38%及48%左右(p<0.05),desmin分布发生改变,表达量在m RNA及蛋白水平分别升高132%及116%左右(P<0.05)。结论:TGF-β1可诱导足细胞TRPC6表达上调且分布变化,TRPC6高表达可影响nephrin、desmin表达及desmin的分布,这可能是TRPC6参与足细胞损伤的机制之一。第二部分TRPC6在TGF-β1诱导足细胞损伤中的分子机制目的:探讨基因敲低TRPC6对TGF-β1干预下足细胞nephrin、desmin、caspase9表达及细胞凋亡的影响。方法:体外培养小鼠肾足细胞,用脂质体法将针对TRPC6 shRNA干扰序列载体PGPU6/GFP/Neo-TRPC6-mus-581及对照质粒空载体PGPU6/GFP/Neo-NC转染至足细胞,转染24及48小时后用用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,同时48小时后用western-blot检测TRPC6蛋白表达水平评估转染效率。实验分为正常对照组,TGF-β1干预组,TGF-β1+PGPU6/GFP/Neo-TRPC6-mus-581组(TRPC6低表达组),TGF-β1+PGPU6/GFP/Neo-NC组(空载体组),干预48小时后用western blot和real time PCR检测caspase9、desmin、nephrin蛋白和m RNA表达水平,DAPI染色观察凋亡细胞核形态学变化,用流式细胞术检测各组细胞凋亡率。结果:转染48h时足细胞表达绿色荧光蛋白较24h时明显增强,与正常对照组相比TRPC6低表达组TRPC6蛋白水平较正常对照组明显下降(P<0.05),空载体组TRPC6蛋白表达水平无明显变化。与空白对照组相比,TGF-β1干预48小时后caspase9、desmin蛋白和m RNA表达水平显著升高(P<0.01),nephrin蛋白和m RNA表达水平明显下降(P<0.05),敲低TRPC6表达上述变化不明显。DAPI结果显示,TGF-β1干预后足细胞凋亡增多并出现典型凋亡细胞核形态学改变。流失细胞术结果显示,TGF-β1干预组足细胞凋亡率为14%+2.1%,TRPC6低表达组凋亡率为10.9%+0.56%(P<0.05),空载体组细胞凋亡率较TGF-β1干预组无明显差异。结论:TGF-β1能诱导足细胞凋亡,减少nephrin表达,增加caspase9、desmin表达,其机制可能与上调TRPC6表达密切相关,敲低TRPC6表达能逆转上述变化,对足细胞具有保护作用。