论文部分内容阅读
腭是口腔颌面部重要器官之一，参与发音、吸吮和吞咽等功能。腭的发育是一个复杂过程，任何环节出现差错都会造成腭裂，因此对腭裂形成的机制研究就显得至关重要。腭的形成是上皮和间充质相互作用的结果，并且多种信号通路参与腭的发育过程，如BMP、Wnt、Shh及FGF信号通路等。目前利用基因工程小鼠研究腭发育与腭裂发生的分子调控机制的主要方法是特异性激活或敲除某个分子的基因表达，但对整个信号通路的抑制或激活尚缺乏研究。 目的:本研究利用Osr2-cre工具鼠，在小鼠腭间充质中分别时空特异性过表达Noggin（BMP信号通路拮抗剂）以及组成性激活BMPIA型受体，从而研究阻断或激活BMP信号分子通路对腭发育的作用。 方法:利用骨染色法观察胚胎小鼠下颌的大体形态发育，利用Masson染色法进行具体形态学分析;通过BrdU标记法比较腭板细胞增殖水平，利用细胞划痕实验检测细胞迁移能力，并通过体外器官培养观察腭板上抬变化;通过免疫组织化学分析BMP经典和BMP非经典信号通路活性蛋白的分布情况，同时利用Sp7/Osterix免疫组织化学分析腭骨成骨分化的能力。 结果:(1)Osr2-cre;pMes-Noggin小鼠与Osr2-cre;pMes-caBmpRIA(Osr2-cre;caBmpRIA)小鼠下颌发育完整，无小颌畸形;但腭骨体积缩小，均有明显的腭裂表型。(2)BrdU标记结果显示:在胚胎E13.5天，Osr2-cre;pMes-Noggin小鼠腭前部舌侧与颊侧间充质以及颊侧上皮细胞增殖数比野生型小鼠显著减少，舌侧上皮细胞增殖未见差异;而腭后部的上述各部位细胞增殖水平与野生型相比未见差异。(3)E13.5天Osr2-crepMes-Noggin小鼠腭突体外培养显示:腭板可翻转且细胞迁移能力无变化，说明Osr2-cre;pMes-Noggin小鼠腭板上抬能力未受影响。(4)免疫组织化学显示:与野生型相比，p-Smad1/5/8在Osr2-cre;pMes-Noggin小鼠腭后部表达范围缩小，在Osr2-cre;caBmpRIA小鼠腭前部间充质中广泛表达，而p-Erk和p-p38表达无明显差别，说明是BMP经典信号通路调控腭的发育，而BMP非经典信号通路可能不参与调控。(5)Sp7/Osterix免疫组化染色结果:与野生型腭前部相比，Osterix在Osr2-cre;pMes-Noggin小鼠腭前部表达没有差异;但在腭后部，Osterix同样表达在Osr2-cre;pMes-Noggin小鼠舌侧间充质中，但表达范围显著缩小;在E15.5天，Osterix在Osr2-cre;pMes-Noggin和Osr2-cre;caBmpRIA小鼠腭骨上的表达范围变小、细胞凝集区范围缩小。同时，E16.5天Masson连续冠状切片显示:Osr2-cre;pMes-Noggin和Osr2-cre;caBmpRIA小鼠腭骨体积变小。说明抑制或激活BMP信号通路均可影响腭骨成骨分化。 结论:BMP信号通路在腭间充质时空特异性抑制或激活可以导致腭裂发生，主要通过BMP经典信号通路而达成的，其作用机制是影响腭板细胞增殖和成骨分化能力，而不影响腭板抬升。