研究背景:进入21世纪后,随着人类的生活方式的改变,环境污染逐渐恶化,及生育年龄的增长等因素,成年男性精子质量呈持续下降趋势。精子要经过长距离运动才能与卵细胞相遇并受精,精子的运动主要借助于尾部鞭毛的摆动,因此精子的尾部运动是正常受精的必要条件。男性不育占所有不孕不育中约50%,男性不育的遗传背景高度复杂,主要表现为:精子形态学和睾丸组织学表型的多样性。据不完全统计,至少有2000个基因参与精子发生与运动。弱精子症是男性不育的常见原因。男性不育中约90%为精子数量下降和(或)弱精子症。A型激酶锚定蛋白4(AKAP4)是AKAPs支架蛋白家族中X染色体连锁成员,锚定cAMP依赖性蛋白激酶A(protein kinase A,PKA),在减数分裂后期精子形成过程中尾部主段纤维鞘的组装和成熟精子尾部运动中发挥重要作用。纤维鞘由两条纵柱及横肋柱构成,占精子尾部全长的大部分,参与信号转导及糖酵解活动。蛋白质组学分析纤维鞘至少由26种蛋白组成,其中AKAP4是纤维鞘中最丰富的蛋白之一。免疫电镜结果显示AKAP4表达在纤维鞘的纵柱及环形肋柱中,其编码AKAP4基因只在精子减数分裂后期转录。既往研究表明AKAP4基因的异常会导致精子尾部的多种形态异常(multiple morphological abnormalities ofthe sperm flagella,MMAF),表现为纤维鞘缺失、活动力下降、尾部卷曲、弯曲、不规则、尾部变短等。但是关于AKAP4基因缺失对精子尾部形成的作用机制及相关蛋白尚无系统的研究。本课题拟构建Akap4基因缺失小鼠模型,研究Akap基因在精子发生、发育过程中的作用;探讨新型基因的治疗靶点为治疗男性不育提供理论依据和治疗思路。目的:探讨Akap4基因在小鼠精子形成过程中的作用,研究Akap基因缺对小鼠精子纤维鞘其他蛋白组分的影响及Akap4基因在睾丸中精子发生的过程中的网络调控作用,揭示纤维鞘相关蛋白缺失导致男性不育的机制,最终为诊断与治疗男性不育寻找新的思路。方法:首先,构建Akap4基因敲除小鼠模型,观察正常小鼠与Akap4基因敲除小鼠的精子形态学、活动力等表型;其次,利用电镜对精子的超微结构进行观察与分析;进而,通过免疫荧光技术定位分析精子纤维鞘蛋白,并对睾丸曲精细管进行PAS染色、免疫荧光及超微结构观察与分析;最后,对睾丸生殖细胞进行单细胞RNA测序。结果:通过CRISPR/Cas9技术成功构建Akap4基因敲除(KO)小鼠,与正常小鼠对比,发现Akap4-KO小鼠精子活力及前向运动活力显著下降,具有显著差异(P<0.01);Akap4-KO小鼠精子尾部卷曲、缩短比例约为91.9%,具有显著差异(P<0.01)。通过扫描及透射电镜发现Akap4-KO小鼠精子主段纤维鞘的纵柱缺失,导致3、8号外层致密纤维杂乱分布于异常扩大的尾部中,对应的两对外周二联微管也异位分布。正常的“9+2”微管结构受到破坏,中央微管移位;在近膜处可见点状高电子密度影,为纤维鞘横肋柱的残留结构。睾丸透射电镜发现Akap4-KO小鼠曲精细管精子尾部未见正常纤维鞘结构。免疫荧光结果同样显示:Akap4-KO小鼠精子的3、8号ODF及“9+2”微管结构在中段之后的尾部呈现出杂乱分布的特征;AKAP3、GAPDHS、CABYR表达未受影响,表达量降低;小鼠生殖细胞单细胞RNA测序结果表明:Akap4基因缺失使小鼠延伸期精子的Step15-16发生阻滞,证实Akap4基因在精子形成的Step15、Step16发挥重要作用。结论:Akap4基因缺失会引起小鼠精子的纤维鞘异常,造成精子尾部主段的形态异常,精子活力低下,最终导致雄性小鼠不育。而Akap4基因缺失对小鼠的睾丸生精功能无明显影响。本实验结果首次证实Akap4基因缺失使精子纤维鞘的纵柱缺失,引起3号及8号外层致密纤维脱离“9+2”微管结构,并且发现横肋柱仍部分残留。Akap4基因缺失下调纤维鞘组分AKAP3、CABYR及GAPDHS的表达。Akap4基因缺失影响小鼠精子尾部纤维鞘结构的组装,但对小鼠精子尾部形成过程的启动无明显影响。首次通过单细胞RNA测序技术检测到Akap4基因缺失使小鼠延伸期精子的Step15-16发生阻滞,表明Akap4基因在精子形成的Step15、Step16发挥重要作用。本研究探讨了Akap4基因在精子发生、发育过程中的作用机制;为治疗男性不育提供理论依据和治疗思路。