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猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的,以呕吐、水样腹泻、脱水为特征的急性和高度传染性病毒性疾病。各日龄猪均可感染PEDV,但在仔猪中具有较高的死亡率,是引起哺乳仔猪早期死亡的重要病原之一。PEDV主要通过粪-口途径传播,因此采用口服免疫是预防和控制PEDV感染的最有效途径。利用肠道乳酸菌作为活菌载体进行PEDV的口服免疫,既具有常规灭活疫苗的安全性,又具有弱毒疫苗的持久性,同时还能够增强机体非特异性免疫和非特异性抗菌抗腹泻能力。利用乳酸菌基因组表达PEDV保护性抗原,不需要额外添加诱导物即可稳定表达外源蛋白,能够充分发挥乳酸菌黏膜免疫的优势。本研究利用乳酸菌Δupp ATCC 393高效表达位点丙酮酸水合酶（enolase,eno）基因位点作为乳酸菌基因组的插入位点,利用双交换同源重组技术将PEDV主要保护性抗原S1插入到Δupp ATCC 393乳酸菌基因组上,以期提高乳酸菌基因组外源蛋白的表达效率,使得PEDV S1基因可以整合到细菌染色体上并随着染色体进行稳定的复制;另外为了比较乳酸菌基因组和质粒表达系统的差异,构建了质粒表达PEDV主要保护性抗原S1重组乳酸菌pPG-SD-S1/Δupp ATCC 393;将构建的重组菌Δupp ATCC 393-S1和pPG-SD-S1/Δupp ATCC393口服免疫小鼠和仔猪,探讨其免疫应答水平。主要研究成果如下:获得干酪乳杆菌肽聚糖水解酶核糖体结合位点和信号肽序列与S1基因（SD-S1序列）的融合片段,构建pPG-SD-S1重组质粒,电转至Δupp ATCC 393获得质粒表达S1蛋白的pPG-SD-S1/Δupp ATCC 393重组菌;获得上游同源臂PA、SD-S1序列、下游同源臂PB的融合片段,构建温敏型重组载体p GBHCupp-S1,电转至Δupp ATCC 393后,通过反复升温以及含有5′-氟尿嘧啶的SDM培养基筛选后获得基因组表达S1蛋白的Δupp ATCC 393-S1重组菌。为评价Δupp ATCC 393-S1和pPG-SD-S1/Δupp ATCC 393重组菌免疫效果,本研究以小鼠为动物模型,进行口服免疫,同时设PBS组和Δupp ATCC 393组作为对照。检测免疫后70天内小鼠的泪液、鼻液、生殖道黏液、粪便以及肠黏液中抗PEDV SIg A抗体和血清中Ig G抗体水平。结果表明,与对照组相比,SIg A和Ig G抗体水平在免疫后第7天开始显著性升高（P＜0.01）,均在免疫后第42天（第二次加强免疫后14天）达到峰值,之后逐渐下降;口服免疫重组菌第42天,小鼠血清中抗体的中和活性较对照组（PBS组和Δupp ATCC 393组）相比显著升高;与对照组相比,口服免疫重组菌小鼠的脾淋巴细胞增殖显著性升高（P＜0.01）,且呈现剂量依赖性;口服免疫重组菌小鼠血清中的细胞因子IL-4、IL-2、IL-10、IL-12、IL-17和IFN-γ的分泌水平均显著高于对照组（P＜0.01）;重组菌口服免疫小鼠后脾细胞CD4+T和CD8+T细胞含量均显著高于对照组（P＜0.01）;此外,与口服免疫pPG-SD-S1/Δupp ATCC393组相比,口服Δupp ATCC 393-S1组在PEDV SIg A和Ig G抗体水平、体外中和实验、脾淋巴细胞增殖实验、细胞因子水平检测和脾细胞CD4+T、CD8+T细胞含量均具有较高水平。根据小鼠口服免疫原性分析比较,将免疫原性更好的Δupp ATCC 393-S1重组菌和PBS（对照组）口服免疫新生仔猪,以评价其免疫效果。在初次免疫2d后,口服免疫Δupp ATCC 393-S1重组菌仔猪的肛拭子和鼻拭子中抗PEDV特异性SIg A抗体水平与照组相比出现显著性升高（P＜0.01）,并随着免疫天数的增加持续升高;初次免疫第6d,口服免疫Δupp ATCC 393-S1重组菌的仔猪血清中抗PEDV特异性Ig G抗体水平与对照组相比显著性升高（P＜0.01）,仔猪血清中抗PEDV Ig G抗体中和活性（1:56.32）显著高于对照组（P＜0.01）;在初次免疫第6d,与对照组相比,口服Δupp ATCC 393-S1重组菌仔猪血清中IL-4、IL-17和IFN-γ细胞因子水平均显著性升高（P＜0.01）。为进一步评价表达PEDV主要保护性抗原S1的Δupp ATCC 393-S1重组菌对仔猪的攻毒保护效果,在仔猪出生后的第7 d进行攻毒保护实验,2头口服PBS组的仔猪口服8m L PEDV研磨病料作为攻毒组;为了模拟了自然感染条件,4头口服免疫PBS作为感染组和4头口服免疫Δupp ATCC 393-S1重组菌作为免疫感染组,与攻毒组进行同笼饲养;剩余1头口服PBS的仔猪作为对照组单独饲养。攻毒后每日对各组实验动物进行临床症状评分并采集鼻、肛拭子,通过RT-PCR的方法检测仔猪排毒情况。攻毒第7 d进行空肠的病理学检测、肠道病毒载量测定以及炎性细胞因子检测。结果表明,与攻毒组和感染组相比,免疫感染组的临床症状、病理变化、肠道病毒载量以及促炎因子水平均显著下调,而抑炎因子水平显著上调（P＜0.01）;对PEDV同居感染的保护率为50%,以上结果说明口服免疫Δupp ATCC 393-S1重组菌对PEDV同笼感染具有一定的保护效果。综上所述,本研究分别构建了质粒组成型表达PEDV主要保护性抗原S1重组菌乳酸菌pPG-SD-S1/Δupp ATCC 393和基因组组成型表达PEDV主要保护性抗原S1重组乳酸菌Δupp ATCC 393-S1。小鼠口服免疫两株重组乳酸菌后均能刺激机体产生针对PEDV的黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫。仔猪口服免疫基因组组成型表达重组乳酸菌Δupp ATCC 393-S1后同样能够刺激机体产生针对PEDV的黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫,并对PEDV的同居感染具有一定的保护作用。本研究结果对猪流行性腹泻口服疫苗的研发具有一定的参考意义。