论文部分内容阅读
利普斯他汀(Lipstatin)是从毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini)的发酵液中分离鉴定的含有β内酯结构的天然产物,具有特异性地抑制胰脂肪酶的活性。从1987年分离鉴定以来,利普斯他汀生物合成机制仍不明确。最近,与此生物合成相关的基因簇才被报道,编号为LstA-F六个蛋白负责利普斯他汀的合成,然而其中涉及的酶催化顺序和生化机制仍待确证。 我们通过体内单基因敲除实验确定基因lstA-F与利普斯他汀生物合成相关,并且从突变株△lstE和△lstF的发酵液中分离鉴定了未上载氨基酸,但形成β内酯的中间产物6;突变株△lstC和△lstD合成不含β内酯,酮基未还原的中间产物5;突变株△lstA和△lstB则没有中间产物生成。因此我们推测LstA-D能够催化碳骨架和β内酯的合成。本篇工作主要通过体外酶学活性实验验证LstA-D的酶催化机制。 首先,我们对LstA和LstB催化的碳骨架合成机制进行研究。LstB虽然在生物信息学分析中与KSⅢ具有同源性,但不含有保守的催化三联体。LstA是典型的KSⅢ,具有保守的催化三联体(Cys-His-Asn),可能催化脱羧式缩合反应。我们发现LstA和LstB只在共同表达时才能稳定存在,推测两者可能为特殊的异源二聚体(LstAB)。根据KSⅢ催化机制,我们合成了底物3-羟基十四烷基-5,8-二烯醇酰CoA(化合物1)和己基丙二酰CoA(化合物3),通过体外活性测试和定点突变的方法研究异源二聚体LstAB的催化反应机制。底物1和3经LstAB催化后,我们分离鉴定了缩合后降解的包含酮基的产物23,证实了LstAB的缩合功能。将LstA催化三联体中的Cys和His突变后,相应突变体的活性丧失,说明两氨基酸残基是催化缩合反应的关键残基。然而,我们在突变体的测活体系中发现3脱羧基产物正几酰CoA(化合物2)的积累,我们推测其可能是LstAB直接利用的底物。于是我们合成了化合物2,实验验证LstAB确实以异源二聚体的形式通过非脱羧式克莱森缩合反应催化底物1和2之间的缩合。当LstB60位的Glu突变后,缩合反应不再发生,说明此氨基酸是缩合反应中关键的碱基,用于拔取底物28α位的氢原子,生成的碳负离子中间体亲核进攻底物1。通过进化树分析发现LstA和LstB各自占据独立的进化分支。分析LstB同源序列的相似性网络发现,lstA和lstB同源基因的连续排列方式广泛的存在于不同种属的分枝杆菌中,其中还包括融合于NRPS(Nonribosomal peptide synthetase,NRPS)C端的特殊形式。 LstD和LstAB共孵育后,我们检测到LstD还原产物30。其中酮基还原为羟基减弱了β位的电负性,因此稳定了化合物30中的羧基,我们推测化合物30为甲酰化亮氨酸上载的底物。LstC是多功能域的跨膜蛋白,其N端是AMP依赖的腺苷化功能域,推测负责脂肪酸羧基的活化;C端是推测的内酯化功能域和跨膜结构域,化合物30的羧基被活化后,内酯化功能域则控制β羟基分子内亲核进攻羧基,合成β内酯。 本文对利普斯他汀的生物合成途径做了深入研究,阐明了其碳骨架和β内酯的合成机制。工作中发现了新型的异源二聚体KSⅢ,丰富了硫酯酶超家族蛋白的组成,并有助于了解此家族中蛋白的进化过程和KSⅢ的功能预测。减肥药物Orlistat可在利普斯他汀的基础上通过半合成方法获得,我们对利普斯他汀生物合成过程中酶学机制的研究为后续通过基因工程改造的方法创造高产菌株以及合成生物学的方法直接发酵生产Orlistat奠定了理论基础。