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线粒体脑肌病伴乳酸血症和卒中样发作(MELAS)是一种少见的遗传性疾病,其患病率在西方约为12.48/100,000。MELAS主要是由线粒体DNA(mtDNA)突变导致呼吸链复合物缺陷,引起能量依赖的器官或组织出现相应损害,临床以卒中样发作的脑病、肌无力、高乳酸血症为特点的一组综合症。本课题研究MELAS的临床、影像学表现和肌肉病理特点,中国MELAS的mtDNA突变热点基因以及呼吸链复合物缺陷特点,试图分析临床型、基因型与呼吸链复合物活性三者之间的关系。方法：本研究共收集经临床、病理诊断为MELAS的25例患者,均行头颅CT、MRI和肌肉活检,活检标本进行包括冰冻切片苏木素-伊红(HE)、改良Gomori三色法(MGT)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、细胞色素C氧化酶(COX)、油红0(ORO)、还原型辅酶Ⅰ-四氮唑还原酶(NADH)、抗线粒体抗体染色,以及电镜检查。抽提25例肌肉组织总DNA,13例同期血总DNA。以首尾相接的方法,设计24对引物。对25份肌肉DNA进行PCR、凝胶电泳及测序。运用MutationSurveyor(?)V3.25软件与修正的剑桥参照序列、MITOMAP数据库(截止2011年3月1日)以及Phylotree(截止2011年3月30日)进行比对。100例正常样本验证新发现突变位点,并进行同源性序列比对和蛋白二级结构预测。13例血液DNA采用第四对引物进行PCR及测序,分析mtDNA3243位点测序峰图。就m.3243A>G突变,计算mtDNA血液与肌肉组织异质性比例。MELAS的主要临床症状(肌无力、癫痫、智能障碍)与基因型进行统计学分析。本研究采用低温差速分离法提取25例MELAS和28例正常肌肉标本的线粒体。用比色法定量测定线粒体内膜上呼吸链复合物Ⅰ-Ⅴ(CⅠ-CⅤ)以及柠檬酸合成酶(CS)活性。计算CⅠ/CS、CⅡ/CS、CⅢ/CS、CⅣ/CS、CⅤ/CS的正常值范围,比较MELAS组活性变化。统计学分析呼吸链复合物缺陷与基因型和临床表型(按受累系统)的关系。结果：(1)本组资料提示MELAS患者起病年龄平均24.0±10.0岁,确诊年龄28.5±12.2岁。首发症状以癫痫(52%)、头痛(36%)、视物模糊(32%)为多,主要临床表现以肌无力(64%)、癫痫(60%)、智能减退(48%)为多；血清肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)正常或轻度升高,部分出现CK-LDH倒置；5例头颅CT在基底节和/或小脑见钙化,所有患者头颅MRI均显示颅内单个或多个累及皮层的病灶,表现为T1W呈等、低信号,T2W、FLAIR及弥散加权(DWI)呈高信号；肌肉病理可见破碎红纤维(RRF)；SDH部分肌纤维深染及SDH强反应性血管(SSV)；22例(88%)COX染色见肌纤维周边活性升高,SSV周边COX活性升高；抗线粒体抗体染色见部分肌纤维褐色沉着。(2)25例MELAS线粒体基因检测结果共发现692个多态位点(polymorphisms),其中652个为单核苷酸多态性位点(SNP),34个为已报道疾病相关位点(reported mtDNA base substitution disease mutations),6个新发现突变位点。本组MELAS突变基因发生病例数依次为:MT-TL1(76%), MT-ND3(68%), MT-CYB(64%), MT-ND2(36%), MT-ND6(32%), MT-DLOOP (28%)。其他还有MT-RNR1、MT-TT、MT-TC、 MT-TK、MT-TW、MT-TH、MT-TE、MT-TA、MT-ND5、MT-ND4、MT-CO1、MT-CO2、MT-ND1、 MT-ATP6基因。最多见的突变位点为m.3243A>G,有19例,占76%。经统计学分析后未发现临床型与基因型具有相关性。肌无力症状为主患者的突变基因依次为MT-TL1、MT-ND3、MT-CYB;癫痫症状为主患者的突变基因依次为MT-TL1、MT-CYB、MT-ND3;智能减退症状患者的突变基因依次为MT-TL1、MT-ND6、MT-ND3和MT-CYB。MT-TL1基因突变的患者中以癫痫、肌无力和内分泌障碍为主要临床表现；MT-ND3基因突变的患者中以癫痫、肌无力、智能减退和内分泌障碍为主要临床表现。线粒体DNA单倍体型分析发现,25例MELAS中,12例H(48%),属西欧亚母系单倍体型；5例M(20%)和8例D(32%),均属典型东欧亚母系单倍体型。发现m.7513insT、m.8477T>C、m.3959G>A、m.1694T>C、m.3995A>G、m.1888G>C突变。经100例正常样本验证和数据库同源性比对,6个点突变均为新突变。经蛋白二级结构预测,m.7513insT、m.8477T>C、m.3959OA、m.3995A>G突变可能不同程度地引起了蛋白二级结构改变。m.3243A>G突变检出率血液样本为肌肉组织的53.8%。(3)本组MELAS患者中,出现呼吸链复合物Ⅰ缺陷的有11例,占44%；呼吸链复合物Ⅱ缺陷有1例；呼吸链复合物Ⅲ缺陷的有9例,占36%；呼吸链复合物Ⅳ缺陷的有10例,占40%；呼吸链复合物V缺陷的有7例,占28%。出现2个呼吸链复合物共同缺陷的有9例,出现3个呼吸链复合物共同缺陷的有4例。经统计学分析后未发现呼吸链复合物缺陷与基因型和临床型之间存在相关性。呼吸链复合物Ⅰ缺陷患者中以MT-TL1和MT-ND基因突变比例最高；呼吸链复合物Ⅲ和Ⅳ缺陷患者中突变基因为MT-TL1、MT-CYB、MT-ND3。呼吸链复合物Ⅰ缺陷患者受累系统依次为骨骼肌、脑、内分泌；呼吸链复合物Ⅳ缺陷患者受累系统依次为脑、骨骼肌、内分泌；呼吸链复合物Ⅲ和Ⅴ缺陷患者骨骼肌和脑病受累例数相同。结论：(1)MELAS是一种具有特殊临床、影像学和病理表现的线粒体脑肌病。(2)本组中国MELAS基因突变以MT-TL1基因m.3243A>G突变最为多见,其次为MT-CYB基因m.15043G>A突变,第三位为MT-ND3基因m.10398A>G突变。(3)本组病例以东欧亚母系单倍体型M为主。(4)共发现6个新突变位点m.7513insT、 m.8477T>C、m.3959G>A、m.1694T>C、m.3995A>G、m.1888G>C。(5) MELAS患者呼吸链复合物缺陷以呼吸链复合物Ⅰ缺陷最多。(6)肌肉是进行MELAS基因和生化检测的极佳选材。本课题从MELAS的临床、基因和呼吸链复合物特点三方面进行研究,详细分析了中国人MELAS的临床、基因和生化特点,总结了丰富的数据资料,为临床医生更好地从临床发现和诊断MELAS提供了实验依据,也为深入研究中国人MELAS线粒体基因组特点提供了理论基础。