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第一章高糖对甲状腺乳头状癌K1细胞增殖及PI3K/Akt/Nrf2信号通路的影响研究目的观察不同浓度葡萄糖对甲状腺乳头状癌K1细胞增殖的促进作用;初步探讨高糖对甲状腺乳头状癌K1细胞核因子-E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)蛋白表达及核转位的影响并研究其可能的上游信号通路。研究方法1.以不同浓度葡萄糖(5.5、10、25、50)mmol/L干预K1细胞,分别于12、24、36、48h采用MTT比色分析法检测各组K1细胞增殖率,同时设相同渗透压组作为对照。2.根据MTT结果,将甲状腺乳头状癌K1细胞分为正糖组(5.5mmol/L葡萄糖)、高糖组(25mmol/L葡萄糖)和高渗组(25mmol/L甘露醇),各组均分别于0、12、24、48h提取细胞,采用Western Blot法检测Nrf2、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)和磷酸化Akt(phosphorylated-Akt,p-Akt)表达水平;采用细胞免疫荧光法分析各组Nrf2在细胞内的分布情况;使用Spearman相关性分析法检测高糖作用下K1细胞增殖分别与Nrf2、PI3K蛋白和p-Akt/Akt的相关性。研究结果1.随葡萄糖浓度升高,K1细胞增殖率改变,25mmol/L葡萄糖浓度下K1细胞增殖达到峰值(148.76±5.19)%,50mmol/l葡萄糖浓度时K1细胞增殖率下降(84.72±3.26)%,与5.5mmol/l葡萄糖浓度时K1细胞增殖率比较均有统计学差异(p<0.01)。2.同一葡萄糖浓度作用下随时间延长K1细胞增殖率发生改变,12h明显升高,24h达峰,随后下降。3.25mmol/L葡萄糖干预K1细胞24h时,K1细胞内Nrf2、PI3K和p-Akt/Akt表达及Nrf2在细胞核分布的比例(Nrf2:0.869±0.075、PI3K:0.783±0.020、p-Akt/Akt:0.480±0.048、Nrf2细胞核比例:91.2%,260/285)均达峰值,并且它们随时间的变化均与K1细胞增殖率变化同步。4.Spearman相关性分析表明高糖组Nrf2、PI3K及p-Akt/Akt表达均与K1细胞增殖率呈正相关,相关系数r分别为0.908、0.910、0.916,p<0.01。5.渗透压升高对K1细胞增殖及Nrf2、PI3K蛋白表达、p-Akt/Akt等均无明显影响(p>0.05)。研究结论1.甲状腺乳头状癌K1细胞增殖率随葡萄糖浓度和作用时间的变化而改变,25mmo/l葡萄糖浓度作用24h时,K1细胞增殖率达高峰。2.高糖可能通过促进Nrf2表达及核转位,从而促进甲状腺乳头状癌K1细胞增殖,这可能与高糖上调K1细胞内PI3K/Akt信号通路有关。第二章小檗碱抑制高糖诱导的甲状腺乳头状癌K1细胞增殖及可能的机制研究目的观察小檗碱对高糖诱导的甲状腺乳头状癌K1细胞增殖的抑制作用;探讨小檗碱对高糖诱导的甲状腺乳头状癌K1细胞Nrf2蛋白表达及核转位的影响,并初步探究其发挥作用的可能信号通路,以期为早期防治糖尿病合并甲状腺乳头状癌治疗提供新的思路和方法。研究方法1.高糖(25mmol/L)加入不同浓度的小檗碱(0、10、40、80)μmol/L共同干预K1细胞24h时,采用MTT比色分析法检测各组K1细胞增殖情况,设正糖(5.5mmol/L)作为对照。2.采用Western blot检测各组Nrf2、PI3K、Akt、p-Akt表达水平,细胞免疫荧光法分析各组Nrf2在细胞内的分布,设正糖(5.5mmol/L)作为对照。研究结果1.与正糖组比较,高糖组K1细胞增殖率、PI3K、p-Akt/Akt、Nrf2表达及Nrf2在细胞核分布的比例均显著升高(增殖率:(126.64±5.41)%vs(87.31±3.67)%;PI3K:(0.425±0.019)vs(0.272±0.039);p-Akt/Akt:(0.446±0.021)vs(0.168±0.035);Nrf2:(0.597±0.014)vs(0.308±0.026);Nrf2细胞核比例:(93.0%,265/285)vs(23.1%,45/195),p<0.01)。2.与高糖组比较,高糖加入10、40、80μmol/L小檗碱后各组K1细胞增殖率((111.76±4.10)%、(70.03±2.18)%、(32.41±3.76)%)均下降(p<0.05),80μmol/L小檗碱组增殖抑制作用最强,同时40μmol/L小檗碱组增殖抑制作用高于10μmol/L小檗碱组。3.高糖加入不同浓度小檗碱后各组PI3K、p-Akt/Akt、Nrf2表达及Nrf2在细胞核分布的比例,与高糖组比较均下调(p<0.05),且其变化均随小檗碱的浓度升高而更加显著。研究结论小檗碱呈浓度依赖性抑制高糖诱导的K1细胞增殖,这可能与小檗碱抑制高糖诱导的PI3K/Akt信号通路过度激活从而下调Nrf2蛋白表达及核转位有关。