论文部分内容阅读
本研究将从抗旱、耐盐、抗寒植物柽柳（Tamarix androssowii）中克隆得到的eIF1A基因,构建到酵母表达载体pYES2中,对其进行酿酒酵母的遗传转化;并对重组酵母进行盐碱胁迫,以验证柽柳eIF1A基因的耐盐性;接着制备了该基因植物侵染的工程菌液,并利用农杆菌介导的叶盘转化法将eIF1A基因导入山新杨基因组中,通过对转基因山新杨的盐碱胁迫试验,对eIF1A基因进行进一步的功能验证。主要实验结果如下:（1）将eIF1A基因与酵母表达载体pYES2连接,获得了pYES-eIF1A重组质粒,并进一步将重组质粒整合到酿酒酵母INSc1菌株中,获得重组酵母INVSc1（pYES-eIF1A）;随机挑选重组酵母的单菌落进行PCR扩增,初步证实eIF1A基因已整合到了酿酒酵母的基因组中。（2）对INVSc1（pYES-eIF1A）和对照菌株进行半乳糖诱导,以研究外源基因eIF1A在酵母中的的表达情况;Northern杂交结果表明,INVSc1（pYES-eIF1A）重组酵母经诱导后能够正确表达。（3）对重组酵母INVSc1（pYES-eIF1A）进行了NaCl、Na2CO3、高温和低温胁迫处理,处理结果证实INVSc1（pYES-eIF1A）酵母的抗逆性明显高于对照INVSc1（pYES2）菌株;初步认为重组酵母处于逆境胁迫时,eIF1A基因的组成型表达增强了酵母在逆境下蛋白质合成的功能,从而增强了酵母对逆境的耐受能力。（4）采用根癌农杆菌介导的转化法对山新杨进行遗传转化,共获得21余株卡那霉素抗性芽,对其进行PCR检测,结果有15株为阳性转基因植株;进一步进行Northern杂交检测,结果表明外源基因能够在转录水平上表达。（5）对5个转基因株系进行了NaCl胁迫处理,分析了逆境胁迫条件下转基因山新杨与非转基因对照的丙二醛（MDA）含量、过氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、叶绿素含量和可溶性蛋白等指标的变化。结果表明:NaCl胁迫处理后,各株系的叶绿素含量呈现先下降后上升的趋势,但转基因株系整体上升的幅度大于非转基因对照;各个株系的SOD活性和POD活性明显高于非转基因对照,5个株系中T10株系表现最佳,其SOD活性和POD活性是非转基因对照的1.19和2.77倍;各个转基因株系的可溶性蛋白含量高于对照,其中T6株系表现优秀,其可溶性蛋白含量是非转基因对照的1.76倍;各个转基因株系的MDA含量低于非转基因对照,其中T10株系表现最佳,对照的MDA含量是T10的2.21倍。综合以上结果,eIF1A基因的组成型表达能够不同程度提高转基因山新杨逆境胁迫下的耐受能力,证实eIF1A基因具有提高植物耐盐性的功能;同时综合各个转基因株系几项生理指标的变化,认为转基因株系T10对盐碱胁迫的抗性最强,是理想的耐盐株系,可用作造林树种。