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近年来,恶性肿瘤的发病率和死亡率日益增长,已经成为威胁人类健康的重要原因之一。以自由基为基础的肿瘤治疗已广泛应用于临床,自由基主要包括过氧化物（Peroxides）、超氧化物（Superoxides）、羟基自由基（Hydroxyl radicals,·OH）和单线态氧（Singlet oxygen,~1O2）等,可对脂质、蛋白质和DNA造成损伤,引起氧化应激,进而诱导细胞凋亡。基于5-氨基酮戊酸（5-Aminolevulinic acid,ALA）的自由基治疗已经被FDA批准用于临床的肿瘤治疗。ALA是光敏剂原卟啉IX（protoporphyrin IX,Pp IX）的前驱体,具有超低的光敏毒性,进入细胞内可发生ALA-Pp IX-heme的生物转化。ALA在线粒体中生成具有光敏活性的Pp IX,其在光照下生成~1O2损伤肿瘤细胞的线粒体。但是,Pp IX在胞内会进一步被转化成无光敏活性的血红素（heme）,导致自由基的产生发生中断,从而降低了ALA的自由基治疗效果。因此,构建一个能够持续地产生自由基的治疗体系是提高ALA自由基治疗的迫切需求。受到ALA天然转化过程（ALA-Pp IX-heme）的启发,本课题构建了一个不间断的自由基产生器（Uninterrupted free radical generator,UFRG）,通过细胞内的自组装将无用的heme转化为过氧化物酶模拟物,能够持续产生自由基来诱导肿瘤细胞凋亡,进而增强肿瘤治疗。UFRG的制备过程为:将负载ALA的树枝状大分子聚合物聚酰胺胺（Polyamidoamine,PAMAM）包封到红细胞膜（Red blood cell membrane,RBCM）囊泡内,并使用G-四聚体结构的AS1411对其进行表面修饰。该体系主要具备以下特点:（1）ALA进入胞内发生生物转化,在线粒体内生成光敏剂Pp IX,在激光照射下激发氧气（Oxygen,O2）生成~1O2;（2）Pp IX转化生成的无光敏活性的代谢物heme可与AS1411原位自组装,“变废为宝”将无用的heme转化为功能性过氧化物酶模拟物,催化过氧化氢（Hydrogen peroxide,H2O2）生成·OH,实现“~1O2-·OH”不间断的自由基产生。有趣的是,~1O2和·OH分别特异性地在线粒体和细胞核内产生,进一步增强了自由基对肿瘤的损伤效果。我们已经证明了UFRG在激光照射后6 h仍能持续地产生自由基,且其自由基产量是非组装组的3.3倍。体内抗肿瘤效果显示,UFRG的体内抑瘤率达80%。总之,该自由基治疗体系通过胞内自组装实现了自由基的持续性产生,增强了基于ALA的肿瘤治疗。具体研究内容如下:1、UFRG的制备及表征首先氨基修饰的PAMAM(第5代,28826 g mol-1)被用作载体负载ALA制备ALA/PAMAM纳米粒,然后通过梯度挤压法制备ALA/PAMAM@RBCM纳米囊泡,最后借助二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺（1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide（polyethyleneglycol）],DSPE-PEG-MAL）在其表面修饰AS1411适配体（DSPE-PEG-MAL作为连接ALA/PAMAM@RBCM和AS1411的桥梁）,得到最终制剂UFRG。UFRG中ALA的负载效率为43.69±2.22%,表面修饰的AS1411在UFRG中的含量为0.76±0.08μg mg-1。透射电子显微镜（Transmission electron microscope,TEM）、动态光散射（Dynamic light scattering,DLS）等结果证实了UFRG的成功制备,其粒径约为180 nm,并且具有良好的分散性,水合粒径为399.5±4.73 nm,电位为-19.07±1.67 m V。为了对UFRG的基本性质进行考察,我们首先通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western blot,WB）实验证实了UFRG中仍然存在CD235a、CD41、CD47等关键蛋白。接着证明了UFRG能够在酸性环境中快速释放药物。然后,通过荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer,FRET）效应和圆二光谱（Circular dichroism spectra,CD光谱）实验证明了AS1411和heme能够发生自组装,并且两者是通过π-π相互作用的外部结合的方式结合的。电子自旋共振（Electron spin resonance,ESR）和2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2’-Azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）,ABTS）显色实验证明了AS1411/heme组装体具有过氧化物酶的活性,能够高效催化H2O2产生·OH。最后,我们证明了UFRG在生理介质下的长期稳定性。2、UFRG体外抗肿瘤活性的研究本章以小鼠皮肤黑色素瘤细胞（Mouse cutaneous melanoma cell,B16-F10cell）为模型,对UFRG的体外抗肿瘤活性进行评价。首先WB实验证实了B16-F10细胞的细胞膜和细胞核里均有过量的核仁素蛋白的表达。接着,我们通过流式细胞术分别考察了RAW 264.7细胞和B16-F10细胞对UFRG的摄取行为,结果表明UFRG具有“免疫逃逸”效应和对B16-F10细胞的靶向能力。其次,“溶酶体逃逸”实验结果证明UFRG能够介导ALA和AS1411从溶酶体中逃逸。线粒体和Pp IX的共定位实验表明ALA诱导生成的光敏剂Pp IX能够特异性地聚集在线粒体内。通过共聚焦激光扫描显微镜（Confocal laser scanning microscope,CLSM）和流式验证了AS1411和heme在胞内的自组装,并且形成的过氧化物酶模拟物能够靶向进入细胞核,这为胞内自由基的持续性产生以及原位损伤细胞核提供了基础。然后,我们分别通过~1O2、H2O2、·OH和活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的特异性荧光探针,揭示了UFRG进入细胞后能够持续地产生自由基的机制。通过对线粒体膜电位和核DNA的考察,证明了UFRG能够有效诱导线粒体和细胞核的损伤。活-死细胞染色实验和凋亡检测结果,证明在激光照射下UFRG可有效诱导肿瘤细胞的凋亡和坏死。细胞抑制率结果表明,在光照条件下,UFRG处理后的细胞生存率仅为18.01%,这证明了UFRG能够通过不间断的自由基产生,有效抑制B16-F10细胞的生长和增殖。3、UFRG体内抗肿瘤活性的研究以荷黑色素瘤的C57BL/6小鼠为动物模型,考察UFRG的体内抗肿瘤活性。体内分布结果显示UFRG能够通过实体瘤的高通透性和滞留（Enhanced permeability and retention,EPR）效应和AS1411对肿瘤的靶向作用有效蓄积到肿瘤部位。治疗期间的肿瘤体积变化曲线和解剖后的肿瘤质量显示,与未治疗（Saline）组相比,UFRG组在激光照射作用下能够有效抑制肿瘤生长,抑瘤率达到80%。更重要的是,体内FRET实验结果表明,AS1411和heme在体内仍能够发生自组装,这为体内不间断的自由基产生奠定了基础。通过使用细胞色素C（Cytochrome C,Cyt-C）、磷酸化组蛋白H2AX（Phosphorylated Histone H2AX,γ-H2AX）和二氢乙啶（Dihydroethidium,DHE）对肿瘤组织切片进行免疫荧光染色,结果显示,与其他组相比,UFRG（+）组（这里（+）代表激光照射）肿瘤部位的线粒体和细胞核损伤最严重,肿瘤组织产生了更多的自由基。对肿瘤组织进行苏木素-伊红（Hematoxylin and eosin,H＆E）染色,结果表明,UFRG（+）治疗的小鼠肿瘤切片出现了显著的细胞数量减少、细胞核皱缩等现象。原位末端转移酶标记技术（Transferase-mediated d UTP-biotin nick end labeling assay,TUNEL）染色结果显示,UFRG（+）治疗的小鼠肿瘤组织凋亡程度最高。在治疗期间,小鼠体重无明显变化;而且H＆E染色结果显示,治疗后各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾等主要器官没有明显的病理变化,表明所制备的不间断自由基产生器在体内具有良好的生物相容性。以上结果表明UFRG（+）在体内能够实现不间断的自由基产生,能够增强基于ALA的自由基治疗。总之,本课题构建了一种能够通过胞内自组装来实现不间断的自由基产生的纳米体系,该体系能够通过胞内的自组装,转变无用的物质为功能酶,实现自由基的不间断产生。体内外治疗结果表明该不间断的自由基产生器能够有效地抑制肿瘤生长,增强基于ALA的肿瘤治疗。