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研究背景食管癌在我国高发,且病死率高,由于早期诊断方法有限,预后不良,5年生存率10%-25%。食管早癌主要采用内镜治疗,术后五年生存率超过95%。食管癌的发展侵袭转移是由多因素共同参与,通过各种信号通路调节,它们之间相互协调制约。因此寻找参与食管癌发生发展的重要分子并探讨其在食管癌发生中的分子机制,对提高食管癌的早期诊断,寻找新的治疗靶点,提高病人生存率有重要意义。近年来研究发现,Nrf2是维持细胞的氧化还原平衡必不可少的,是细胞内抗氧化剂和Ⅱ相解毒酶的关键调节因子,在氧化和外源性应激条件下通过调节细胞适应性起着保护性作用,并抑制肿瘤的发展和转移,同时Nrf2活化有助于肿瘤的进展和放化疗抵抗。FAT蛋白是钙黏超家族中分子量最大的一类,它们参与调节形态发生、控制生长、平面细胞极性,其中FAT1和FAT4与肿瘤的发生、发展密切相关。目前FAT4与食管浅表癌、食管癌的关系少有报告,Nrf2与食管浅表癌发生发展的关系还没有报告。目的本研究探讨Nrf2与钙黏蛋白FAT4在食管浅表癌及食管癌组织及外周血单个核细胞(PBMC)中mRNA表达,并分析与临床病理指标之间的关系。方法1.病例收集2016年5月至2016年11月间在山东大学第二医院接受内镜黏膜下剥离术和手术治疗食管鳞癌及上皮内瘤变患者的组织标本及外周血,共43例,以15例正常人的外周血为对照。排除标准:1)术前接受放化疗的患者,2)患者同时有两种或两种以上的肿瘤。按国际TNM分期标准第7版(2009)进行分期,Ⅰ期11例,Ⅱ期8例,Ⅲ期/Ⅳ期12例,其中Ⅳ期患者为术中发现无法进行根治性切除行姑息性治疗。T分期中,T1/T2者14例,T3/T4者17例。无淋巴结转移者17例,淋巴结转移者14例。颈胸上段2例,胸中段18例,胸下段23例。长度小于5cm病变32例,长度大于5cm病变11例。2.Nrf2和FAT4的免疫组化石蜡切片脱蜡至水,EDTA抗原修复15分钟,PBS洗涤三次,3%H202阻断内源性过氧化物酶,山羊血清封闭30min,滴加一抗4℃孵育过夜。切片洗净后,二抗孵育(30分钟),并用DAB显色。切片用苏木精复染,然后洗涤和脱水。以阳性反应为阳性对照,PBS为阴性对照。3.Nrf2和FAT4 mRNA的荧光定量PCR使用人外周血淋巴细胞分离液从人外周血单个核细胞中提取单个核细胞,Trizol裂解细胞,mRNA由氯仿-异丙醇-乙醇沉淀法提取,测定总浓度。取1μl进行cDNA的逆转录合成,PCR扩增:Real-time qPCR采用25μl的反应体系,具体操作参照SYBR(?)Premix Ex Taq TM(RR420A)的使用说明。4.统计学分析计数资料的组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法,计量资料的比较采用t检验,应用SPSS21.0统计软件对结果进行处理,检验水准为α = 0.05。结果1.Nrf2蛋白在食管鳞癌组织和癌旁组织中的表达情况Nrf2在细胞核或细胞质中呈淡黄色或棕褐色颗粒。Nrf2蛋白在病变组织及正常食管组织中的表达阳性率分别为62.79%(27/43)、13.95%(6/43),两组差异具有统计学意义(χ2=21.684,P<0.05),食管浅表癌和进展期食管癌的Nrf2表达的阳性率差异有统计学意义(χ2=18.496,P<0.001),正常食管鳞状上皮组和鳞状细胞癌组(P<0.001)、上皮内瘤变组和鳞状细胞癌组(P<0.001)Nrf2阳性表达率差异有统计学意义,正常食管鳞状上皮组和上皮内瘤变组差异无统计学意义(P>0.05)。临床病理因素分析:Nrf2蛋白表达与病变长度、浸润深度、T分期密切相关(P<0.05),但与病变部位、淋巴结转移、TNM分期无显著相关(P>0.05)。2.FAT4蛋白在食管鳞癌组织及癌旁组织中的表达免疫组织化学显示:免疫组织化学显示:FAT4阳性表现主要为胞浆或胞核染成黄褐色或棕黄色。FAT4蛋白在病变组织及正常食管组织中的表达阳性率分别为32.56%(14/43)、65.12%(28/43),两组之间比较差异具有统计学意义(χ2=9.118,P=0.005<0.05)。食管浅表癌和进展期食管癌的FAT4阳性表达率差异有统计学意义(X~2=9.918,P=0.003<0.05)。正常食管鳞状上皮组和上皮内瘤变组(P=0.188>0.05),上皮内瘤变和鳞状细胞癌(P=0.482>0.05)的FAT4表达阳性率差异无统计学意义,正常食管鳞状上皮组和鳞状细胞癌组(P=0.004<0.05)FAT4蛋白表达阳性率有统计学差异。临床病理因素分析显示:FAT4蛋白表达与浸润深度、T分期、TNM分期相关(P<0.05),但与病变部位、病变长度及淋巴结转移无显著相关(P>0.05)。3.Nrf2 mRNA 和 FAT4 mRNA 在 PBMC 中的表达qPCR检测结果显示,在43例患者和15例对照中,Nrf2 mRNA和FAT4 mRNA在单个核细胞中的表达水平没有明显差异(分别为P=0.068>0.05和P=0.263>0.05)。结论本实验通过检测Nrf2和FAT4蛋白表达状况,可以从分子生物学水平上了解食管癌的恶性程度,对临床治疗起指导作用,可能有助于判断预后。