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第一部分 多肽ZY4的体外抗胰腺癌细胞实验目的:将多小分子蛇多肽ZY4分别与胰腺癌细胞株(PANC-1、BXPC-3)、人胰腺间质细胞HPSC共同孵育,研究蛇多肽ZY4对胰腺癌细胞的增殖抑制作用、促凋亡作用和抑制迁移作用等,探索其作为胰腺癌治疗药物的可能性。材料与方法:将蛇多肽ZY4分别与胰腺癌细胞(PANC-1、BXPC-3)、人胰腺间质细胞共同孵育24h后。(1)CCK8法验证蛇多肽ZY4对胰腺癌细胞及胰腺间质细胞的毒性:将ZY4与胰腺癌细胞株共同孵育,验证ZY4对胰腺癌细胞活力的影响。FITC-PI流式细胞术探究多肽ZY4诱导胰腺癌细胞的凋亡;(3)用划痕实验探究多肽ZY4对细胞迁移能力的影响。结果:CCK8法显示蛇多肽ZY4对BXPC-3细胞毒性较大,对胰腺癌PANC-1细胞及HPSC细胞毒性较小,小分子蛇多肽ZY4有抑制胰腺癌细胞增殖的作用。流式细胞术结果显示随着ZY4浓度的升高,胰腺癌细胞凋亡数量增加。划痕实验结果显示小分子蛇多肽ZY4对胰腺癌BXPC-3细胞的迁移能力有抑制作用。结论:小分子蛇多肽ZY4作为一种抗菌肽,有抑制胰腺癌细胞增殖的能力,对BXPC-3细胞杀伤作用较为明显,可以诱导胰腺癌细胞凋亡。第二部分 基于Plectin-1靶向纳米探针的制备以及性能检测目的:以红细胞膜为载体,包载普鲁士蓝及ZY4,制备靶向纳米探针Plectin1-RCM-PBNP-PEI-Gd-PAA-ZY4-PAA-AF555(Ple-RCM-PBNP·Gd·ZY4),并且对该探针的性能表征检测结果进行研究分析。材料与方法:1.红细胞膜的提取和表面修饰1.1红细胞膜的提取 小鼠取血提取红细胞,使用低渗溶胀法提取小鼠红细胞膜。加入1倍1 ×PBS-EDTA吹打混匀,800 g,4℃,离心5分钟,去除上清黄色液体。继续用4倍0.25×PBS-EDTA清洗,3200 g,离心5分钟,弃上清,重复上述操作至上清液基本澄清。沉淀约加入4倍的0.25×PBS-EDTA,涡旋混匀,16000g,离心10min,去除上清液,继续用0.25×PBS-EDTA缓冲液洗涤至上清无色,全程无菌操作。1.2红细胞膜的修饰 将链霉亲和素与AF555(Alexa Flour 555)荧光(DMF溶解)混匀,摇床上孵育1h,用超滤管去除未结合的荧光分子,离心(4000g,10min,)至上清液无色,最终液体用水重悬至链霉亲和素浓度为10mg/mL。向4mL处理好的红细胞膜内加入1 mg/mL的生物素共30μL,4℃过夜孵育,离心(16000g,1Omin),去除未负载的生物素。沉淀用1 ×PBS-EDTA再洗涤一次,去上清,沉淀用DEPC处理水重悬至8 mL,稀释细胞膜。向8 mL的红细胞悬液中添加40 μL的链霉亲和素荧光(10 mg/mL),然后在37℃条件下摇床避光孵育1h,离心(14000g,1Omin),收集上清。2.探针的制备2.1 PBNP·Gd(PBNP-PEI-Gd)的合成 向 2 mL 的聚乙烯亚胺 PEI(2mg/mL,使用稀HCI调节pH至6)里加入2 mL的普鲁士蓝纳米颗粒(PBNP),800rpm机械搅拌1h,静置2h,收集成品离心(14000g,1Omin),收集沉淀。继续离心直至上清无色,收集所有沉淀,用纯水重悬沉淀至2mL,添加1 mL的GdC13溶液(2 mg/mL),磁力搅拌4h,离心(14000g,10min),去除上清,将沉淀用纯水重悬至2 mL。2.2 PBNP·Gd·ZY4(PBNP·Gd-PAA-ZY4-PAA)的合成 向 2 mL 的聚丙烯酸 PAA(2mg/mL)内加入2 mL的PBNP-Gd溶液,磁力搅拌过夜,离心(14000g,1Omin),去除上清,用纯水重悬沉淀至2 mL。再加入用DEPC水溶解的ZY4,在4℃条件下磁力搅拌反应过夜,离心(14000g,10min),去除上清,用纯水将沉淀重悬,得到PBNP·Gd-PAA-ZY4。向2 mL的PAA(2mg/mL),加入2 mL的PBNP·Gd-PAA-ZY4溶液,磁力搅拌过夜反应。14000g离心1Omin,去除上清,沉淀用纯水重悬至2 mL。2.3 Ple-RCM-PBNP·Gd·ZY4的合成 向Pletin1抗体溶液中加入pH 9.0的碳酸盐缓冲液,涡旋加入生物素(1mg/mL DMF),37度摇床避光孵育1h。向2mL负载AF555的红细胞膜悬液内加入2mL的PBNP·Gd·ZY4溶液,水浴超声2 min,磁力搅拌过夜反应,第二日离心前再次水浴超声2 min,离心(14000g,1Omin),去除上清,将沉淀用纯水重悬至2 mL。将所得产物添加至上述Plectin1溶液中。3.探针的物理化学性能表征使用透射电子显微镜对探针的形态和粒径进行表征;分别测量探针的水动力尺寸和Zeta电位;使用近红外激光器探究探针的光热升温效应;使用小动物荧光成像仪测得探针的荧光强度;使用3.0T磁共振仪器评估成像特点;使用紫外分光光度计及荧光光谱仪检测多肽偶联效率。结果:透射电镜结果显示探针的粒径在126nm左右,探针呈近圆形结构;Zeta电位显示探针最终电位在-25.5mV左右,探针修饰后电荷变化达到要求,探针修饰及包被成功;经红外光照射后,探针的升温效果明显,5分钟内即可达到50摄氏度以上;小动物荧光成像仪成像结果显示随着探针浓度的升高,荧光信号越强;MRI扫描结果显示随着探针浓度的升高,T1成像信号越高;多肽偶联效率达99%。结论:本实验所制备的Ple-RCM-PBNP·Gd·ZY4靶向分子探针具有良好的分散性,小动物荧光成像仪检显示探针表现为红色荧光,多肽偶联效率高,纳米探针在磁共振T1成像中显示为高信号。探针Ple-RCM-PBNP·Gd·ZY4检测结果显示其可以进行荧光成像以及MRI成像,为后续体外细胞实验奠定基础。第三部分 基于Plectin-1靶向纳米探针体外细胞成像及抑制胰腺癌细胞实验目的:将靶向分子探针Ple-RCM-PBNP·Gd·ZY4分别与胰腺癌细胞株(PANC-1、BXPC-3)人胰腺间质细胞共同孵育,探究Ple-RCM-PBNP·Gd·ZY4探针的细胞毒性,并对其靶向性进行评价。材料与方法:将探针Ple-RCM-PBNP·Gd·ZY4分别与胰腺癌细胞(PANC-1、BXPC-3)、人胰腺间质细胞HPSC共同孵育24h后。(1)CCK8法验证普鲁士蓝对细胞的增殖能力影响;(2)CCK8法验证探针对胰腺癌细胞的毒性:将探针与胰腺癌细胞株共同孵育,验证探针对胰腺癌细胞活力的影。(3)运用划痕实验探究探针Ple-RCM-PBNP·Gd·ZY4对胰腺癌细胞迁移能力的影响;(4)近红外光照射后用钙黄绿素和碘化丙啶试剂盒对细胞进行染色,观察分析细胞内活死细胞水平,评估探针对胰腺癌细胞的光热效应;(5)使用荧光显微镜验证探针Ple-RCM-PBNP·Gd·ZY4的荧光成像作用;(6)共聚焦验证探针对胰腺癌细胞的靶向性;(7)探针的生物安全性检测。结果:探针Ple-RCM-PBNP·Gd·ZY4对胰腺癌细胞具有特异靶向性;探针Ple-RCM-PBNP·Gd·ZY4没有明显溶血活性;普鲁士蓝对细胞毒性较小;探针对胰腺癌细胞的增殖具有抑制作用;光热治疗后,探针对癌细胞杀伤作用明显增大;划痕实验显示探针能够抑制胰腺癌细胞迁移。结论:探针能够靶向表达Plectin-1的胰腺癌细胞,生物安全性高,具有很好的光热治疗作用,为探针的体内实验提供了理论依据。